Фенотипическое выражение генов

Фенотипическое выражение генов

Ф-ии гена и его влияние на фенотип зависят от физического положения гена в генетической системе (эффект положения), от совокупности остальных генов (генотипической среды) и от внешних условий. Фенотипическое выражение гена - экспрессивность, так же как и его проявление - пенетрантность, т. е. наличие или отсутствие контролируемого данным геном признака, могут варьировать в зависимости как от внешних условий, так и от генотипа. Под влиянием различных внешних воздействий гены могут изменяться - мутировать. К независимому мутированию способны также элементарные единицы, входящие в состав гена. Гены контролируют процессы синтеза белков в клетках и что генные мутации (изменения химической структуры генов) ведут к изменению химической структуры белков (что в ряде случаев сводится к замене одной аминокислоты другой).

При разных условиях у особей со сходным генотипом фенотипическое выражение данного гена может быть различно. Так, мутация дрозофилы «abnormal abdomen» (фенотипически проявляется в неправильном расположении полосок окраски на брюшке) обнаруживается в фенотипе только при выращивании личинок мух на влажном корме; при использовании сухого корма мутанты ничем не отличаются от нормальных мух.

Кроме того, может варьировать (даже при 100\%-ной пенетрантности) степень фенотипического проявления гена. Признак может быть выражен сильнее или слабее, проявляться более или менее отчетливо в зависимости от внешних условий или от взаимодействия генов друг с другом. Если данный признак сходно выражен у разных особей в данных условиях, говорят о постоянной экспрессивности контролирующего этот признак гена, если же степень выраженности признака варьирует — об изменчивой экспрессивности.

 

Свойства плазмидных векторов

Как автономно реплицирующиеся генетические элементы плазмиды обладают всеми основными свойствами, которые позволяют использовать их в качестве вектора для переноса клонируемой ДНК. Но довольно часто природные (немодиф-ные, несконстр-ные) плазмиды бывают лишены некоторых обязательных для «высококачественного» вектора свойств. К таким важным свойствам относятся:

1) небольшой размер, поскольку эффективность переноса экзогенной ДНК в Е. coli значительно снижается при длине плазмиды более 15 т. п. н.;

2)наличие уникального сайта рестрикции (разрез цепочки ДНК, осуществляемый специальным ферментом (рестриктазой), в который может быть осуществлена вставка;

3) наличие одного или более селективных генетических маркеров для идентификации реципиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК. Поэтому плазмидные вектора приходится создавать с помощью генной инженерии.

 

Структура и свойства ДНК

С хим. точки зрения ДНК — это длинная полимерная молекула, состоящая из повторяющихся блоков — нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из из остатка фосфорной кислоты, присоединённого по 5'-положению к сахару дезоксирибозе, к которому также через гликозидную связь (C—N) по 1'-положению присоединено одно из четырёх азотистых оснований (аденин, гуанин, тимин и цитозин). В подавляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК) макромолекула ДНК состоит из двух цепей, ориентированных азотистыми основаниями друг к другу. Эта двухцепочечная молекула спирализована. В целом структура молекулы ДНК получила название «двойной спирали».

Аз-ые осн-ия одной из цепей соединены с аз-ми осн-ми другой цепи водородными связями согласно принципу комплементарности: А с Т, Г — только с Ц. Разные пары оснований образуют разное количество водородных связей:АТ связаны 2, ГЦ — 3 водород. связями, поэтому на разрыв ГЦ требуется больше Е.

Фосфодиэфирный остов образован фосфодиэфирными связями, кот. возникают м/у 3'-ОН-группой и 5'-ОН-группой. Дезоксирибоза соед-тся с азотистым основанием N-гликозидной связью. Одна цепь связывается со второй цепью связями: водородные, гидрофобные м/у плоскостями азотистых оснований.

I стр-ра ДНК: на одном конце одной цепи ДНК нах-тся 3'-ОН-группа дезоксирибозы (3'-конец), на другом - 5'-фосфатная-группа(5'-конец).Дина ДНК измеряется числом пар комплементарных нуклеотидов (п.н.). Длина 1000 п.н.=340нм, мол. масса 1000 п.н.=60000Да. Последовательность дезоксирибонуклеотидов в одной цепи ДНК соот-ет направлению 5'-3' и кмплем-на послед-сти дезоксирибонуклеотидов в антипарал-ой цепи 3'­-5'. Ковал. связи: фосфодиэф. и гликозидная

II стр-ра ДНК: правозакрученная спиральная полинуклеотидная цепь. Имеет 6 разновидностей. В-форма: d спирали 2,1нм, виток-10 п.о.(пар оснований), шаг спирали 3,4нм, плоскость осн-ий ┴ продольной оси спиралей. Прод. ось спиралей пронизывает стопку оснований посередине. М\у цепями ДНК расположены 2 бороздки – большая и малая.

А-форма: d спирали 2,5нм. виток-11 п.о., шаг спирали 2,8нм. П.о. наклонены под углом 20° к пл-ти ┴ прод-ой оси спирали. Они обвивают продольную ось так, что внутри неё вдоль имеется полость d 0,8нм. Две бороздки, но большая шире и глубже, чем у В-формы.

С-форма: виток сод-ит 9,3 п.о. Основания разных цепей наклонены под углом 6° к пл-сти,┴ оси спирали и немного отн-но друг друга.

Z-форма: левая спирал. один виток вкл-ет 12 п.о. Пентозофосфатные цепи имеют не плавные линии как в В и С формах, а ломанный z-образ. вид. Обладает только одним желобком. Выявлена в повторяющихся послед-ях чередующихся ГЦ или АЦ при наличии др. стабилиз. факторов: высокая конц-ия соли или наличие спец. катионов(спермин и спермидин), высокое сод-ие отриц. супервитков, связывание z-ДНК специф. белков, метилир-ие атомов углерода С-5.

Форма спирали ДНК зав-ит от степени гидратации м-лы: А-форма (крис-ая) сущ-ет при ω% воды не выше 40%, В-форма(паракрис-ая) при ω% более 40%.

Формы С,D,E – правоспиральные обр-ся только в эксперимент. усл-ях и in viva не сущ-ют. А-форма возникает при более высоком сод-ии ионов Na или K в среде, т.е. при меньшей гидратации.

III стр-ра: суперспираль(с.с.) ДНК. При превращении лин. 2-цепоч. ДНК в замкнутую кольц. м-лу ось двойной спирали ДНК м.б. закручена в суперспираль в правую или левую сторону. Кольцевую ДНК, лишённую суперспир. витков наз-ют релаксированной. Для её превращения в суперспирал-ую необ-мо затратить опред-ую Е. Е напряжения суперспир-ой ДНК (Е суперспирализации) прим-но пропорц-на квадрату числа суперспир-ых витков. биол. ф-ии С.С.: с.с. имеет более компактную форму, м.влиять на степень расщепления двойной спирали. Правая с.с. «+», левая «-».Почти все кольц. М-лы ДНК «-» спир-ны. С.С. в хромосомах наиболее стаб-на за счёт гашения отриц. зарядов на фосфорной к-те катионами Ме.

Порядок зацепления L показывает, сколько раз одна цепь пересекает другую, если их спроецировать на плоскость (изм-ся если в обе цепи вносятся разрывы). Ф-ты, меняющие L: топоизомеразы (иниц-ют образование «-» супервитков(гираза).

«-» супервитки образуются за счёт скручивания ДНК против часовой стрелки(влево).

Ф-ии ДНК: хранение и передача ген. инф-ции(путём собств-ой репликации и репарации→CONST вида); несёт инф-ию о собственной рекомбинации (обмен м/у сегментами гомол. хромосом в мейозе в процессе кроссинговера путём разрыва и воссоединения цепей ДНК), т.е. изменении в генах, передающихся по наследству; формирование фенотипа, экспрессия генов а)через синтез мРНК(транскрипция),б) процессинг (созревание иРНК из мРНК) в) синтез белков.

Денатурация(плавление ДНК): 2-ух спирал. стр-ру ДНК м. расплавить в р-ре ↑ t°С или понижая конц-ию соли (происходит не только расхождение цепей, но и нарушается система взаим-ия азот. осн-ий(гидрофоб. взаим-ия), фосфодиэф. связи при этом не разр-тся). Разделение цепей ДНК происходит в опр. интервале t°С, сред. точка этого интервала - t°С плавления данной ДНК или точка плавления. Формамид дестаб-ет водор. связи м/у осн-ми, тем самым снижая t плавления. М-лы, обогащ. ГЦ парами плавятся при более выс. t°С.

 

Белки репликации прокариот

1) dna-B(мол. масса 250кДа, число м-л в клетке 20): даёт возможность проймазе инициировать синтез РНК, поступая в точку ilv;

2) Хеликаза (rap-белок) (65кДа, 50 м-л): расплетает двойную спираль (генерируются «+» витки);

3) ОЦ-белки (ДНК-связывающие, плавящие Б) (74кДа,300 м-л): стабилизирует одноцепочечные участки ДНК;

4) ДНК-гираза (400кДа, не обн-ны): вводит «–» супервитки за счёт АТФ;

5) Проймаза (60кДа, 100 м-л):синтезирует РНК-затравку;

6) голофермент ДНК-полимеразы-3(>300кДа, 20 м-л): синтезирует основную массу ДНК;

7) ДНК-полимераза-1 (109кДа, 300м-л): удаляет затравку, заполняет бреши более одного нуклеотида

8) ДНК-лигаза (74кДа, 300 м-л): соединяет ковалентно концы ДНК.

ДНК-полимераза катализирует образование фосфодиэфирной связи только в том случае, если основание очередного нуклеотида комплементарно соответствующему основанию матричной цепи. ДНК-полимераза может включать в ДНК некоторые аналоги оснований: урацил или 5-Br-урацил вместо тимина, гипоксантин вместо гуанина.

ДНК-полимераза I сод-ит 2 активности: 1)3'- 5'-экзонуклеазная активность 36 кДа,выполняет функцию редактирования; 2) 5'-3'-эндонуклеазную активность, с массой 75 кДа, заделывает бреши.

ДНК-полимераза I может присоединять дезоксирибонуклеотиды к затравочной цепи, но она не способна катализировать соединение двух цепей ДНК или замыкание одной цепи ДНК.

ДНК-лигаза - фермент, катализирующий образование фосфодиэфирной связи между двумя цепями ДНК. Фермент этот активен при усл-ях: 1) наличии свободной ОН-группы на 3-конце одной цепи ДНК и фосфатной группы на 5'-конце другой. 2)для реакции соединения цепей требуется источник энергии. У Е. coli и других бактерий эту роль выполняет NAD+, тогда как в клетках животных и зараженных бактериофагом клетках данная реакция осуществляется за счет энергии АТР) 3) наличие соседней цепи ДНК.

ДНК-лигаза заделывает одноцепочечные разрывы в остове двухспиральной ДНК. Этот процесс необходим для нормального синтеза ДНК, для репарации поврежденной ДНК и для сращивания (сплайсинга) цепей ДНК при генетической рекомбинации. На образование фосфодиэфирной связи в остове ДНК расходуются две богатые энергией фосфатные связи.

активность ДНК-полимераз II и III(открыты спустя 15 лет после I) маскировалась высокой активностью полимеразы I.

Общие св-ва ДНК-полимераз 1,2,3:

1. Они катализируют направляемый матрицей синтез ДНК из предшественников dNTP.

2. Для проявления их активности необходима затравка со свободной 3'-ОН-группой,

3. Синтез идет в направлении 5'—>3'.

4. Они обладают 3'—>5'-экзонуклеазной активностью.

Эти полимеразы различаются по характеру предпочитаемых ими матриц. Для полимераз II и III оптимальными матрицами служат двухцепочечные ДНК, имеющие короткие одноцепочечные пробелы. Полимераза I, наоборот, предпочитает протяженные одноцепочечные участки, соседствующие с двухспиральными участками. Максимальные скорости катализа in vitro для этих ферментов также различаются: полимераза I присоединяет 10 нуклеотидов в секунду, а полимераза II - 0,5 и полимераза III - 150 нуклеотидов в секунду.

 

Генетическая карта E.coli

Генетическая карта — схема расположения структурных генов и регуляторных элементов, а также генетических маркеров в хромосоме.

В условиях быстрого синтеза ДНК E.coli была установлена генетич. карта E.coli путём обнаружения вновь синтезированных генов через разное время после начала отсчёта. Генов, кот. нах-тся вблизи точки инициации репликации будет больше в быстро растущей к-ре. Отн-ое сод-ие генов определяли методом гибридизации.

1. Репликация нач-тся в строго опр. участке ДНК вблизи гена Ilv, локализ. на 74 мин станд-ой ген. карты E.coli

2. Репликация идёт в обоих направлениях одновременно с приблиз-но одинак. скоростью, т.е. сущ-ет 2 репликац. вилки: одна движется по часовой, др.-против часовой стрелки. Они встречаются вблизи Trp-маркера на 25 мин ген. карты, в точке противопол. началу репликации.

Репликация ДНК эукариот

Для изучения применяли метод радиоавтографии с Н₃⁺-тимидином: в к-ру клеток человека на корот. время вводят радиоактивную метку.Затем клетку мягко лизируют. ДНК дают расправиться на пов-ти предметного стекла, покрытого фоточувствительной эмульсией. после чего автограф изучают в световом микроскопе. Реплицировавшаяся ДНК выявляется в виде цепочки гранул серебра. Этим методом м.определить скорость и направление движения репликационной вилки.

Выявили, что реплик. вилки у эукариот перем-тся на 50 нуклеотидов/сек, т.е. в 10 раз медленнее, чем у бактерий. Это связано с трудностью распаковки эукариот. хромосом (от гистонов). Средняя хромосома чел-ка состоит из одной м-лы ДНК, содержащей 150 млн.п.н.Для репликации такой м-лы одной репликац. вилкой потреб-тся 800 ч (0,02*150*10⁶=3*10⁶ сек, где 0,02 - время на синтез 1 нуклеотида. Выяснили, что по каждой эукариот. хромосоме движ-ся одноврем-но много вилок. Далее обнаружили: 1) сайты инициации репликации обычно инициируются группами (по 20-80 сайтов). Их называют репликац. единицами

2) В ходе фазы S актив-ся все новые единицы, пока вся ДНК не будет реплицирована.

3) отдельные точки начала репликации внутри репликац. единицы отстают друг от друга от 30 тыс. до 300 тыс.п.н. Т.е. в среднем на одну петлю хроматина м. приходиться одна точка начала репликации.

4) В каждой точке инициации образуется пара репликац. вилок и по мере их расхождения от сайта инициации формируется репликац. глазок. Остановка вилки происходит только при столкновении с репликац. вилкой, движущейся в противопол. направлении или при достижении конца хромосомы. т.е. по каждой хромосоме эукариот м. двигаться независимо друг от друга много репликац. вилок (глазков), образующих 2 целые дочерние спирали ДНК.

У эукариот кодон инициации всега АУГ (соот-ет метионину), у бактерий – АУГ (реже ГУГ).

Репликация ДНК прокариот

2-ух цеп. ДНК и РНК(у вирусов) м.служить матрицами для синтеза ДНК. Предшеств-ми синтеза ДНК явл-ся дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфаты. (В основе метода:ДНК осаждается кислотами, а нуклеотиды-предшественники остаются в растворе; включение меченных предшественников ДНК. Для исследования выбрали бактерии Е. coli→деление этих клеток происходит всего лишь за 20 мин (время генерации→их можно выращивать в больших количествах. Экстракт Е. coli инкубировали с радиоактивным дезокситимидин-5'-трифосфатом. Радиоактивность обнаруживалась в небол. кол-вах.

Синтез ДНК осущ-ет ДНК-полимераза I - это единая полипептидная цепь с массой 109 кДа; кат-ет послед-ое присоед-ие ДНК-звеньев к цепи ДНК.

Компоненты, необходимые для синтеза: 1) 4 дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфата(dNTP): dATP, dGTP, dTTP и dCTP; 2) ионы Mg2+; 3) затравочная цепь, или затравка, со свободной 3'-ОН группой; 4) матричная ДНК.

Реакция элонгации (удлинения) цепи, катализируемая ДНК-полимеразой, происходит путем нуклеофильной атаки 3'-ОН-концом матрицы ближайшего к рибозе атома фосфора очередного dNTP. В результате образуется фосфодиэфирный мостик и одновременно высвобождается пирофосфат. Элонгация цепи ДНК происходит в направлении 5'-3'. За секунду одна молекула ДНК-полимеразы I присоединяет примерно 10 нуклеотидов. Полимеризация процессивна, т. е. фермент присоединяет много нуклеотидов, оставаясь связанным с одной матрицей.

Репликационная вилка – участок ДНК, где происходит одновр-ое расплетение и синтез ДНК. Активное расплетание родительской двойной спирали под действием фермента — белка rep(хеликаза). На разделение каждой пары оснований затрачиваются примерно две молекулы АТР. Затем каждая из разделенных цепей родительской ДНК взаимодействует с несколькими молекулами белка, связывающегося с одноцепочечной ДНК (ОЦ-связывающий Б, дестабилизирующий спираль (Б ДС), или плавящий Б). Роль ОЦ-связывающего белка - стабилизировать одноцепочечные участки ДНК для выполнения ею роли матрицы.При расплетании ковалентно замкнутой кольцевой молекулы ДНК возникают топологические проблемы, так как расплетание двойной спирали вызывает образование положительных супервитков → вносят ДНК-гиразу (Эта топоизомераза удаляет положительные супервитки, внося одноцепочечные разрывы и затем заделывая фосфодиэфирные связи в остове ДНК, ДНК-гираза может активно вводить отрицательные супервитки в ковалентно замкнутую кольцевую ДНК за счет энергии гидролиза АТР).

Репликация ДНК – полуконсервативный процесс, т.к. одна цепь ДНК – родит-ая, а вторая – достраивается заново в процессе репликации.

Цепи родительской ДНК антипараллельны. Следовательно, общее направление синтеза ДНК должно быть 5'—>3' для одной из дочерних цепей и 3'—>5' для другой. Однако все известные ДНК-полимеразы синтезируют ДНК в направлении 5'—>3', а не 3'—>5'.

Кажущийся рост второй цепи ДНК объяснил Оказаки, который обнаружил, что значительная часть новосинтезированной ДНК существует в виде коротких фрагментов. Такие фрагменты длиной около 1000 нуклеотидов (фрагменты Оказаки) существуют в течение непродолжительного времени в непосредственной близости от репликационной вилки. По мере прохождения репликации эти фрагменты соединяются друг с другом ковалентно под действием ДНК-лигазы и образуют одну из дочерних цепей. Другая новая цепь синтезируется непрерывно или почти непрерывно. Та цепь, которая образуется из фрагментов Оказаки, называется отстающей цепью, а та, что синтезируется без разрывов или почти без разрывов,- ведущей цепью. И фрагменты Оказаки, и ведущая цепь синтезируются в направлении 5'—>3'. Прерывистая сборка отстающей цепи позволяет путем полимеризации в направлении 5—>3' на атомном уровне получать общий рост цепи в направлении 3'—>5'.

Механизм репликации ДНК E.coli: 1) Особая РНК-полимераза (праймаза), кот. не нуждается в затравке синтез-ет корот. цепь РНК от 10 до 200 пар нуклеотидов, комплементарную одной из цепи ДНК-матрицы.

2) 3'-ОН группа концевого рибонуклеотида этой цепи РНК служит затравкой для синтеза ДНК под действием голофермента ДНК-полимеразы III.

3) РНК-компонент этого РНК-ДНК-гибрида гидролизуется под действием ДНК-полимеразы I.

4) После удаления РНК из новообразованных цепей между фрагментами ДНК остаются бреши. ДНКполимераза I, которая хорошо приспособлена для синтеза ДНК на одноцепочечной матрице, заполняет эти бреши.

Действию праймазы предшествует образование предзатравочного промежуточного комплекса, состоящего как минимум из пяти белков. Один из них - белок dnaB - может передвигаться вдоль ДНК, используя энергию гидролиза АТР. Белок dnaB может служить сигналом для активации праймазы. Специфичность инициации очередного цикла репликации может обеспечиваться белками, доставляющими белок dnaB точно в область гена ilv, где находится точка начала репликации хромосомы E.coli. Время начала репликации ДНК должно быть скоординировано с делением клетки. И действительно, бактериальная хромосома ассоциирована с впячиванием клеточной мембраны.

Две репликационных вилки движутся в противопол. направлении со скоростью 500 нуклеотидов/с, пока не закончится репликация кольцевой ДНК. Они удваивают геном за 40 минут.

 

Транскрипция у прокариот

Транскрипция – синтез РНК на ДНК-матрице. У большинства прокариот транскрипция осуществляется с помощью одной той же РНК-полимеразы(у эукариот мРНК,рРНК и тРНК транскриб-тся разными РНК-полимеразами).

Основные типы РНК: 1)рибосомная рРНК (85-95%) (синтез-тся в ядрышке.Большая и малая субъединица). Более крупная рРНК образует с белками рибонуклеопротеидный комплекс, называемый большой рибосомной субъединицей, а рРНК меньшего размера – комплекс, называемый малой рибосомной субъединицей. Во время синтеза белков субъединицы объед-тся с образованием рибосомы. 2)транспортная тРНК (4-10%).75 нуклеотидов. 60 видов тРНК. Структура клеверного листа; область кодона на 3'-конце и антикодона в центре молекулы. Антикодон – послед-сть из 3 нуклеотидов, кот. распознает специф. кодон в мРНК и опр-ет какая а.к. будет присоединена к 3'-концу с помощью спец. ф-тов – аминоацил-тРНК-синтетаз. 3) информационная мРНК (3-5%), гетерогенная группа, т.е. много типов иРНК.

Матрицей при синтезе РНК служит определенный участок одной из цепей ДНК. РНК-полимераза копирует этот участок, последовательно соединяя друг с другом с помощью 3'-5'-фосфодиэфирных связей рибонуклеотиды в соответ-ии с правилом комплем-сти. В ходе транскрипции новосинтез-ая м-ла РНК отсоединяется от ДНК, и двойная спираль восстанавливается.Чтобы обеспечить транскрипцию только отдельных сегментов ДНК, должны сущ-ать некие сигнальные послед-сти, указ-щие, где начинается транскрипция (точка инициации) и где она останавливается (точка терминации).Сигнал инициации обычно располагается перед кодирующей послед-тью, а сигнал терминации – вслед за ней. Промотор — участок ДНК длиной в несколько десятков нуклеотидов, куда присоединяется РНК-полимераза и откуда начинается транскрипция. Терминатор — участок ДНК, содержащий сигнал (последовательность) окончания транскрипции.

Цикл транскрипции состоит из трех стадий: инициации; элонгации; терминации. Им предшествует узнавание промотора или подготовительная стадия, на которой РНК-полимераза узнает промотор и связывается с ним. Одновременно происходит локальное расплетение ДНК примерно на 10 пар нуклеотидов.

1 ) Инициация. На этой стадии происходит образование нескольких начальных звеньев РНК.До этого комплекс полимераза-ДНК не стабилен и способен распадаться.

2 ) Элонгация. Продолжается дальнейшее расплетение ДНК и синтез РНК по кодирующей цепи. Он, равно как и синтез ДНК, осуществляется в направлении 5'- 3'.

3) Терминация. Как только полимераза достигает терминатора, она немедленно отщепляется от ДНК, локальный гибрид ДНК-РНК разрушается и новосинтезированная РНК транспортируется из ядра в цитоплазму. На этом транскрипция заканчивается.

У прокариот струк. ген – непрерывный участок м-лы ДНК. Транскрипция начинается со связывания РНК-полимеразы с промоторм, и далее последоват-но копир-тся весь структурный ген от первого нуклеотида до последнего с образованием функц-ой мРНК.

 

Транскрипция у эукариот

Транскрипция – синтез РНК на ДНК-матрице. в отличие от прокариот, у эукариот мРНК, рРНК и тРНК транскрибируются разными РНК-полимеразами. Цикл транскрипции состоит из трех стадий: инициации; элонгации; терминации. Им предшествует узнавание промотора или подготовительная стадия, на которой РНК-полимераза узнает промотор и связывается с ним. Одновременно происходит локальное расплетение ДНК примерно на 10 пар нуклеотидов.

1 ) Инициация. На этой стадии происходит образование нескольких начальных звеньев РНК.До этого комплекс полимераза-ДНК не стабилен и способен распадаться.

2 ) Элонгация. Продолжается дальнейшее расплетение ДНК и синтез РНК по кодирующей цепи. Он, равно как и синтез ДНК, осуществляется в направлении 5'- 3'.

3) Терминация. Как только полимераза достигает терминатора, она немедленно отщепляется от ДНК, локальный гибрид ДНК-РНК разрушается и новосинтезированная РНК транспортируется из ядра в цитоплазму. На этом транскрипция заканчивается.

У эукариот большинство структурных генов(на кот. синт-тся мРНК) состоит из нескольких дискретных кодирующих областей (экзонов), разделенных некодирующими областями (интронами). По завершении транскрипции эукариотического структурного гена интроны вырезаются из первичного продукта транскрипции с помощью ферментов, а экзоны сшиваются друг с другом «торец в торец» (сплайсинг) с образованием функц. мРНК. Первичный транскрипт сод-ит poly(А)-хвост на 3'-конце и метилированный нуклеотид G («кэп») на 5'-конце (защищает РНК от гидролиза 5'-экзонуклеазами). После транскрипции инторны вырезаются из первичного транскрипта (процессинг) и на образовавшейся функц-ой РНК синтезируется белк. мол-ла (трансляция).

Различия от прокариот: 1)В эукариотических клетках после инициации транскрипции происходит модификация 5'-трифосфата в образующейся цепи за счет присоединения так называемого кэпа – метилированного остатка гуанозина. 2)Кроме того, у большинства транскриптов происходит также модификация 3'-концов - по окончании транскрипции к ним присоединяется цепочка из остатков аденина, образующая характерный ро1уА-«хвост» (исключением из этого правила являются мРНК гистонных белков). 3)У всех эукариот при транскрипции ДНК образуются молекулы РНК трех вышеназванных классов. Все они участвуют в процессе трансляции - третьей разновидности матричных процессов передачи информации - от РНК к белку.

 

Экспрессия генов эукариот

Экспрессия генов — это процесс, в ходе которого наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок. Экспрессия генов может регулироваться на всех стадиях процесса: и во время транскрипции, и во время трансляции, и на стадии посттрансляционных модификаций белков.

Регуляция работы генов у эукариот. Регуляция транскрипции. Принцип регуляции - обратная связь. Единица транскрипции у эукариот - транскриптон. Он состоит из неинформативной (акцепторной) и нформативной (структурной) зон. Неинформативная зона начинается промотором с инициатором. Далее следует группа операторов, за котырыми расположена информативная зона. Она образована структурным геном, разделенным на экзоны (информативные участки) и интроны (неинформативные). Заканчивается транскриптон терминатором.

Работу транскриптона регулирует несколько генов-регуляторов дающих информацию для синтеза нескольких белков-репрессоров. Когда индукторы освобождают гены-операторы от белков-репрессоров, РНК-полимераза разрывает водородные связи между двумя цепочками ДНК транскриптона и по правилу комплементарности на нем сначала синтезируется большая м-ла проинформационной РНК, списывающая инф-цию как с информативной так и с неинф-ой зон. В дальнейшем в клетках происходит процессинг - ферментативное разрушение неинф-ой части РНК и расщепление ферментами рестриктазами инф-ой части на фрагменты, соот-ие экзонам. М-ла и-РНК, соответствующая экзонам структурного гена, формир-тся посредством сплайсинга (сплавления) отдельных информативных фрагментов ферментами лигазами. Далее и-РНК выходит из ядра, идёт в рибосомы, где и происходит синтез белка-фермента, необходимого для расщепления индукторов.

Наличие интронов в генах эукариот - уник. явление. Кроме того, в геномах эукариот сод-тся послед-сти нуклеотидов, многократно повторяющихся. Повторяющиеся гены выполняют разнообразные ф-ии: являются промоторами, регулируют репликацию молекул ДНК участвуют в кроссинговере, отделяют экзоны и интроны и др.

 

 

Пробиотики и БАВ (Громовых. Т.И)

 

1. Понятие пробиотики, пребиотики и синбиотики. Пробиотики и функциональное питание.

ПРОБИОТИК «prebiosis» значит симбиоз, т.е. сообщество (сосуществ) 2х или более организмов, способствующее жд партнеров. «Probiotic» - организм, участвующий в симбиозе и благоприятствующий жизни. 1)«пробиотик» H.Lilly и K.Stilberg в 1965 году в качестве антонима антибиотика для обозначения микробных метаболитов, обладающих способностью стимулировать рост микроорганизмов. 2) 1974 году Parker использовал этот же термин для обозначения микробных препаратов, обладающих способностью регулировать микробную экологию кишечника. Согласно его определению, мембраны, включения и др.), способные регулировать баланс микробной составляющей кишечника. 3) R. Filler обозначил пробиотиками любые препараты из живых микроорганизмов, оказывающие при введении в организм хозяина благотворный эффект за счет коррекции кишечной микрофлоры. В качестве корректоров могут выступать как монокультуры, так и сообщества микроорганизмов из различных видов и штаммов. Затем он уточнил определение – это препараты из живых микроорганизмов или стимуляторов роста микробного, животного, раст происхождения, оказывающие благотворное влияние на индигенную.

4)В 1995 г. в Германии на международном форуме предлагалось обозначит термином «пробиотики» любые микробные препараты, содержащие живые или мертвые клетки МО, или их компоненты. Это подверглось критике, т.к. вакцины подпадали под этот термин. 5) Учёные G.R. Gibson и M.B. Roberfroid предложили назвать пр-ми только пищевые добавки микробного происхождения, проявляющие позитивные эффекты через регуляцию кишечной микрофлоры.

Таким образом, наиболее соответствующим современному уровню знаний является определение пробиотиков: это живые микроорганизмы и вещества микробного или иного происхождения, оказывающие при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические функции, биохимические и поведенческие реакции организма хозяина через оптимизацию его микроэкологического статуса.

ПРЕБИОТИКИ Не подвергающиеся микробной ферментации пищевые добавки органического происхождения, способные оказывать также благоприятный эффект на организм человека (животного) через селективную стимуляцию роста и/или активности представителей нормальной микрофлоры кишечника. Пребиотики – функциональные пищевые ингредиенты в виде вещества или комплекса веществ, обеспечивающие при систематическом употреблении в составе пищевых продуктов оптимизацию микроэкологического статуса организма человека.

К пребиотикам относят олигосахариды (фруктоолигосхариды), комплекс бифидус-фактор (смесь близких по строению олигосахаридов, связанных с N-ацетилглюкозамином. За последние годы идентифицировано более 130 олигосахаридов женского молока

СИНБИОТИК Функциональный пищевой ингредиент или продукт, представляющий собой комбинацию пробиотиков и пребиотиков, оказывающих синергический эффект на физиологические функции и метаболические процессы в организме человека, называется. Действие синбиотиков основано на синергизме комбинации пробиотиков и пребиотиков, з а счет которого не только наиболее эффективно имплантируются вводимые микроорганизмы в желудочно-кишечный тракт хозяина, но и стимулируется его собственная микрофлора.

ЭУБИОТИКИ Чаще всего это фармакопийные препараты из живых лиофильно высушенных микроорганизмов, предназначенные для коррекции микрофлоры (не пищевой продукт!).

Систематическое употребление продуктов и препаратов с пробиотическими свойствами оказывает регулирующее действие на организм человека и обеспечивает оздоровительный эффект. Кроме того, пробиотики безвредны для организма, не оказывают побочных явлений и не вызывают к ним привыкания. Особенно эффективны пробиотики при лечении желудочно-кишечных заболеваний.

2. История создания пробиотиков, роль русских ученых в формировании представлений об иммунитете, значении питания и составе кишечной микрофлоры.

В период бурного развития МБ ХIX и нач. ХХ столетий благодаря выдающимся достижениям Л. Пастера, Р. Коха, П. Эрлиха и др. удалось установить, что многие заболевания чел. и жив. связаны с распространением МО – возбудителей инфекций. Были разработаны разл препараты, вакцины, чувствительные методы диагностики, позволяющие предотвращать такие заболевания как чума, бешенство, холера, сифилис и др. В 1899 году ученик И.И. Мечникова Генри Тиззиер впервые выделил основные представители бифидобактерий в чистую культуру из кишечника здорового грудного ребенка. В 1907 г. И.И. Мечников высказал предположение, что причиной возникновения многих заболеваний является совокуп. эффект на клетки и ткани макроорганизма разнообразных токсинов и метаболитов, продуцируемых МО, присутствующими на слизистых и коже, а главное – в пищевар. тракте чел-ка. Затем внимание было снижено к роли МФ кишечника в физиологии и здоровье. в 50-60-е годы 20-го столетия первопричину заболеваний стали связывать с нарушениями в центральной нервной системе, в 50-70 гг. – с нарушениями баланса электролитов и стероидных гормонов. В 60-80 гг. – с наследственным и иммунным генезисом чел-ка и жив-х. С нач 80-х годов увеличение числа болезней стали связывать с ухудшением состояния окр среды. Однако, еще И.П. Павлов акцентировал внимание, что пища в здоровье человека носит главенствующий характер. Изменение диеты современного человека хар-ся резким уменьшением поступления в его организм мол.кисл. бактерий и увеличением кол-ва белков, сахаров, уменьш пищ волокон и минер.питания. Все это изменило состав МФ пищевар тракта.

В н.в. норм МФ пищевар тракта рассматривают как совокупность множества МО, хар-хся определенными свойствами и занимающими тот или иной биотоп в организме чел-ка. Она включает десятки и сотни видов, находящихся в соответственном численном соотношении. Основным фактором, регулирующим состав и соотношение МФ, является субстрат. Недостаток или избыток субстрата может привести к изменению соотношения определенных групп МО.

С первых минут появления чел-ка на свет его кожа, слизистые и кишечник обсеменяются МФ, число и разнообразие которых определяется составом МФ матери, санитарным состоянием среды, типом вскармливания. Однако имеются некоторые закономерности формирования МФ жкт. В перв часы жизни в кишечнике новорожденного встречаются преимущестенно микрококки, стафилококки, энетерококки и клостридии. Позднее появляются энтеробактерии (грамотриц киш.палочки), лактобациллы и бифидобактерии. Это не обязательно МО, обитающие в кишечнике матери. Затем появляются в большей степени неспоровые облигатно-анаэробные бактерии (бифидобактерии, эубактерии, бактероиды, стрептококки, спириллы).

Для установления микробной экологии жкт новорожденных по своему составу ко взрослой необходимо несколько лет. Особенно обильна МФ нижних отделов кишечника, где содержание бактерий составляет 10^-12- 10^-13 КОЕ на 1 г. Суммарно в кишечнике взрослого человека находится более 1 кг МО. Здесь обнаружены более 500 видов бактерий, среди которых число анаэробных превышает в 100-1000 раз аэробных. Такие представители, как энтеробактерии, включая кишечную палочку, стафилококки, грибы и другие аэробы, составляют от 1 до 4 %. На жизнеобеспечение МФ кишечника человека в среднем расходуется до 10 % поступившей с пищевой энергии и 20 % объема принятой пищи.

Представители норм МФ присутствуют в организме чел-ка и животных в виде фиксированных (иммобилизованных) к определенным рецепторам микроколоний, заключенных в биопленку. Биопленка, как перчатка, покрывает кожу и слизистые открытых окружающей среде полостей здорового чел-ка и жив-х и состоит помимо микроколоний МОов, из экзополисахаридов различного состава микробного происхождения, а также муцина, продуцируемого бокаловидными клетками слизистых. С функц точки зрения биопленку можно сравнить с плацентой, выполняющую роль регулятора взаимоотношений между МО и окр средой. На биопленке происходит превращение поступающих пищевых субстратов под действием микробной трансформации в промежуточные либо конечные продукты.

Установлено, что норм МФ и продукты ее метаболизма участвуют в регуляции газового состава кишечника и других полостей организма хозяина; принимает участие в метаболизме белков, углеводов, нуклеиновых кислот, липидов, в водно-солевом обмене. МФ обеспечивает защиту от колонизации чужеродными микроорганизмами, выполняя защитную роль, принимает участие в рециркуляции стероидных соединений и др. макромолекул, в детоксикации экзогенных и эндогенных соединений. Кроме того, микрофлора обладает морфокинетическим действием (стимулирует рост клеток эпителиальных клеток слизистой), влияет на перистальтику кишечника, на количество потребляемой пищи, выполняет иммуногенную (стимулирует развитие и функции лимфоидной ткани и других иммунокомпетентных органов, усиливает гуморальный и тканевый иммунитет, стимулирует фагоцитоз, продукцию иммуноглобулинов, интерлейкинов, цитокинов и др.) и антимутагенную функцию. МФ служит источником энергии для клеток хозяина (образование жирных кислот), является хранилищем генетическог