Ферменты клонирования в технологии р-ДНК

Технология рРНК – совокуп-сть экспер. методов переноса ген. мат-ла (ДНК) из одного организма в другой. Клонирование – процедура вращивания и отбора клонов, несущих нужные рРНК. В бол-ве случаев при клон-ии во всём мире в кач-ве реципиентных генов исп-ют штаммы E.coli, кот. называют «рабочей лошадкой».

Конструирование рекомб. мол-л ДНК осущ-ся с помощью ф-тов: рестрикции(гидролиза): рестриктазы; легирования (сшивания): лигазы; синтеза: обратные транскриптазы.

Эндонуклеазы – ф-ты рестрикции, способные: узнавать опред. послед-сти осн-ий в 2-ух спирал. ДНК, расщеплять обе цепи ДНК.

С их помощью исследуют: стр-ру хромосом, послед-сти нуклеотидов в ДНК (секвенирование). Произ-ят выделение генов, получение новых м-л ДНК для клон-ия. Рестрицирующие эндонуклеазы обнаружены у разл. прокариот. Биол. роль: расщеплять чужеродную ДНК, собств. ДНК при этом не расщепляется, т.к. участки ДНК, узнаваемые собств. рестриктазами в клетке метилированы.

Рестриктазы разделены на 3 группы в зав-ти от доины узнаваемой послед-сти: 1) узнают тетрануклеотиды (Alu-I) из Artrobacter luteus; 2) узнают пентануклеотиды (EcoR-II) из E.coli; 3) узнают гексануклеотиды (Ecor-I) из E.coli. Их название сокращено до 3 букв названия м.о.+обозначение штамма римской цифрой.

Производимые в двух цепях разрывы м.б. расположены либо со сдвигом отн-но друг друга на 1-2 осн-ия, либо строго против друг друга (пол-тся «тупые» концы).

В наст. время рестриктазы дел-тся на 3 класса с учётом метилирования сайта и сайта посадки (RMS-система: R-рестриктаза, M-сайт метилирования, S-сайт посадки ф-та):

I класс: рестриктазы, кот. расщеп. ДНК в произвол. точках с обр-ем различ. фрагментов ДНК; II класс: ф-ты, д. кот. сайты рестрикции и посадки совпадают. Образующиеся фрагменты рестрикции воспроизводятся по длине; III класс: из фага Р-1 объединяют все прочие эндонуклеазы.

Число узнаваемых рестриктазами нукл. послед-тей варьирует от 4 до 13. Рестриктазы расщепл. ДНК через 250 нуклеотидов, исходя из ф-лы уⁿ, где у – кол-во нуклеотидов (Г,У,Т,А), n-число повторов сайтов рестрикции.

Необходим какой-то инструмент для устранения разрыва в сахарофосфатном остове м-лы, т. е. для восст-ия связи между З'-ОН концевой группой одной цепи и 5'-фосфатной группой другой. Таким инструментом является ДНК-лигаза бактериофага Т4 (катал-ет образ-ие фосфодиэфирных связей между концами полинуклеотидных цепей, которые уже удерживаются вместе благодаря спариванию липких концов; «сшивает» тупые концы, которые сближаются друг с другом после того, как объединяемые фрагменты связываются с ферментом).

Технология рек. ДНК в вопросе №16 (если понадобится)

 

Структура и свойства ДНК

С хим. точки зрения ДНК — это длинная полимерная молекула, состоящая из повторяющихся блоков — нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из из остатка фосфорной кислоты, присоединённого по 5'-положению к сахару дезоксирибозе, к которому также через гликозидную связь (C—N) по 1'-положению присоединено одно из четырёх азотистых оснований (аденин, гуанин, тимин и цитозин). В подавляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК) макромолекула ДНК состоит из двух цепей, ориентированных азотистыми основаниями друг к другу. Эта двухцепочечная молекула спирализована. В целом структура молекулы ДНК получила название «двойной спирали».

Аз-ые осн-ия одной из цепей соединены с аз-ми осн-ми другой цепи водородными связями согласно принципу комплементарности: А с Т, Г — только с Ц. Разные пары оснований образуют разное количество водородных связей:АТ связаны 2, ГЦ — 3 водород. связями, поэтому на разрыв ГЦ требуется больше Е.

Фосфодиэфирный остов образован фосфодиэфирными связями, кот. возникают м/у 3'-ОН-группой и 5'-ОН-группой. Дезоксирибоза соед-тся с азотистым основанием N-гликозидной связью. Одна цепь связывается со второй цепью связями: водородные, гидрофобные м/у плоскостями азотистых оснований.

I стр-ра ДНК: на одном конце одной цепи ДНК нах-тся 3'-ОН-группа дезоксирибозы (3'-конец), на другом - 5'-фосфатная-группа(5'-конец).Дина ДНК измеряется числом пар комплементарных нуклеотидов (п.н.). Длина 1000 п.н.=340нм, мол. масса 1000 п.н.=60000Да. Последовательность дезоксирибонуклеотидов в одной цепи ДНК соот-ет направлению 5'-3' и кмплем-на послед-сти дезоксирибонуклеотидов в антипарал-ой цепи 3'­-5'. Ковал. связи: фосфодиэф. и гликозидная

II стр-ра ДНК: правозакрученная спиральная полинуклеотидная цепь. Имеет 6 разновидностей. В-форма: d спирали 2,1нм, виток-10 п.о.(пар оснований), шаг спирали 3,4нм, плоскость осн-ий ┴ продольной оси спиралей. Прод. ось спиралей пронизывает стопку оснований посередине. М\у цепями ДНК расположены 2 бороздки – большая и малая.

А-форма: d спирали 2,5нм. виток-11 п.о., шаг спирали 2,8нм. П.о. наклонены под углом 20° к пл-ти ┴ прод-ой оси спирали. Они обвивают продольную ось так, что внутри неё вдоль имеется полость d 0,8нм. Две бороздки, но большая шире и глубже, чем у В-формы.

С-форма: виток сод-ит 9,3 п.о. Основания разных цепей наклонены под углом 6° к пл-сти,┴ оси спирали и немного отн-но друг друга.

Z-форма: левая спирал. один виток вкл-ет 12 п.о. Пентозофосфатные цепи имеют не плавные линии как в В и С формах, а ломанный z-образ. вид. Обладает только одним желобком. Выявлена в повторяющихся послед-ях чередующихся ГЦ или АЦ при наличии др. стабилиз. факторов: высокая конц-ия соли или наличие спец. катионов(спермин и спермидин), высокое сод-ие отриц. супервитков, связывание z-ДНК специф. белков, метилир-ие атомов углерода С-5.

Форма спирали ДНК зав-ит от степени гидратации м-лы: А-форма (крис-ая) сущ-ет при ω% воды не выше 40%, В-форма(паракрис-ая) при ω% более 40%.

Формы С,D,E – правоспиральные обр-ся только в эксперимент. усл-ях и in viva не сущ-ют. А-форма возникает при более высоком сод-ии ионов Na или K в среде, т.е. при меньшей гидратации.

III стр-ра: суперспираль(с.с.) ДНК. При превращении лин. 2-цепоч. ДНК в замкнутую кольц. м-лу ось двойной спирали ДНК м.б. закручена в суперспираль в правую или левую сторону. Кольцевую ДНК, лишённую суперспир. витков наз-ют релаксированной. Для её превращения в суперспирал-ую необ-мо затратить опред-ую Е. Е напряжения суперспир-ой ДНК (Е суперспирализации) прим-но пропорц-на квадрату числа суперспир-ых витков. биол. ф-ии С.С.: с.с. имеет более компактную форму, м.влиять на степень расщепления двойной спирали. Правая с.с. «+», левая «-».Почти все кольц. М-лы ДНК «-» спир-ны. С.С. в хромосомах наиболее стаб-на за счёт гашения отриц. зарядов на фосфорной к-те катионами Ме.

Порядок зацепления L показывает, сколько раз одна цепь пересекает другую, если их спроецировать на плоскость (изм-ся если в обе цепи вносятся разрывы). Ф-ты, меняющие L: топоизомеразы (иниц-ют образование «-» супервитков(гираза).

«-» супервитки образуются за счёт скручивания ДНК против часовой стрелки(влево).

Ф-ии ДНК: хранение и передача ген. инф-ции(путём собств-ой репликации и репарации→CONST вида); несёт инф-ию о собственной рекомбинации (обмен м/у сегментами гомол. хромосом в мейозе в процессе кроссинговера путём разрыва и воссоединения цепей ДНК), т.е. изменении в генах, передающихся по наследству; формирование фенотипа, экспрессия генов а)через синтез мРНК(транскрипция),б) процессинг (созревание иРНК из мРНК) в) синтез белков.

Денатурация(плавление ДНК): 2-ух спирал. стр-ру ДНК м. расплавить в р-ре ↑ t°С или понижая конц-ию соли (происходит не только расхождение цепей, но и нарушается система взаим-ия азот. осн-ий(гидрофоб. взаим-ия), фосфодиэф. связи при этом не разр-тся). Разделение цепей ДНК происходит в опр. интервале t°С, сред. точка этого интервала - t°С плавления данной ДНК или точка плавления. Формамид дестаб-ет водор. связи м/у осн-ми, тем самым снижая t плавления. М-лы, обогащ. ГЦ парами плавятся при более выс. t°С.

 

Белки репликации прокариот

1) dna-B(мол. масса 250кДа, число м-л в клетке 20): даёт возможность проймазе инициировать синтез РНК, поступая в точку ilv;

2) Хеликаза (rap-белок) (65кДа, 50 м-л): расплетает двойную спираль (генерируются «+» витки);

3) ОЦ-белки (ДНК-связывающие, плавящие Б) (74кДа,300 м-л): стабилизирует одноцепочечные участки ДНК;

4) ДНК-гираза (400кДа, не обн-ны): вводит «–» супервитки за счёт АТФ;

5) Проймаза (60кДа, 100 м-л):синтезирует РНК-затравку;

6) голофермент ДНК-полимеразы-3(>300кДа, 20 м-л): синтезирует основную массу ДНК;

7) ДНК-полимераза-1 (109кДа, 300м-л): удаляет затравку, заполняет бреши более одного нуклеотида

8) ДНК-лигаза (74кДа, 300 м-л): соединяет ковалентно концы ДНК.

ДНК-полимераза катализирует образование фосфодиэфирной связи только в том случае, если основание очередного нуклеотида комплементарно соответствующему основанию матричной цепи. ДНК-полимераза может включать в ДНК некоторые аналоги оснований: урацил или 5-Br-урацил вместо тимина, гипоксантин вместо гуанина.

ДНК-полимераза I сод-ит 2 активности: 1)3'- 5'-экзонуклеазная активность 36 кДа,выполняет функцию редактирования; 2) 5'-3'-эндонуклеазную активность, с массой 75 кДа, заделывает бреши.

ДНК-полимераза I может присоединять дезоксирибонуклеотиды к затравочной цепи, но она не способна катализировать соединение двух цепей ДНК или замыкание одной цепи ДНК.

ДНК-лигаза - фермент, катализирующий образование фосфодиэфирной связи между двумя цепями ДНК. Фермент этот активен при усл-ях: 1) наличии свободной ОН-группы на 3-конце одной цепи ДНК и фосфатной группы на 5'-конце другой. 2)для реакции соединения цепей требуется источник энергии. У Е. coli и других бактерий эту роль выполняет NAD+, тогда как в клетках животных и зараженных бактериофагом клетках данная реакция осуществляется за счет энергии АТР) 3) наличие соседней цепи ДНК.

ДНК-лигаза заделывает одноцепочечные разрывы в остове двухспиральной ДНК. Этот процесс необходим для нормального синтеза ДНК, для репарации поврежденной ДНК и для сращивания (сплайсинга) цепей ДНК при генетической рекомбинации. На образование фосфодиэфирной связи в остове ДНК расходуются две богатые энергией фосфатные связи.

активность ДНК-полимераз II и III(открыты спустя 15 лет после I) маскировалась высокой активностью полимеразы I.

Общие св-ва ДНК-полимераз 1,2,3:

1. Они катализируют направляемый матрицей синтез ДНК из предшественников dNTP.

2. Для проявления их активности необходима затравка со свободной 3'-ОН-группой,

3. Синтез идет в направлении 5'—>3'.

4. Они обладают 3'—>5'-экзонуклеазной активностью.

Эти полимеразы различаются по характеру предпочитаемых ими матриц. Для полимераз II и III оптимальными матрицами служат двухцепочечные ДНК, имеющие короткие одноцепочечные пробелы. Полимераза I, наоборот, предпочитает протяженные одноцепочечные участки, соседствующие с двухспиральными участками. Максимальные скорости катализа in vitro для этих ферментов также различаются: полимераза I присоединяет 10 нуклеотидов в секунду, а полимераза II - 0,5 и полимераза III - 150 нуклеотидов в секунду.

 

Генетическая карта E.coli

Генетическая карта — схема расположения структурных генов и регуляторных элементов, а также генетических маркеров в хромосоме.

В условиях быстрого синтеза ДНК E.coli была установлена генетич. карта E.coli путём обнаружения вновь синтезированных генов через разное время после начала отсчёта. Генов, кот. нах-тся вблизи точки инициации репликации будет больше в быстро растущей к-ре. Отн-ое сод-ие генов определяли методом гибридизации.

1. Репликация нач-тся в строго опр. участке ДНК вблизи гена Ilv, локализ. на 74 мин станд-ой ген. карты E.coli

2. Репликация идёт в обоих направлениях одновременно с приблиз-но одинак. скоростью, т.е. сущ-ет 2 репликац. вилки: одна движется по часовой, др.-против часовой стрелки. Они встречаются вблизи Trp-маркера на 25 мин ген. карты, в точке противопол. началу репликации.