Анализ полиморфизма с помощью ПЦР

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР, PCR) предполагает использование специфических праймеров и получение дискретных ДНК-продуктов амплификации отдельных участков геномной ДНК [2, 36, 50]. Большое количество родственных технологий построено на этом принципе. Наиболее широко используемая RAPD-технология основана на анализе амплифицированных полиморфных фрагментов ДНК с помощью единичных праймеров с произвольной нуклеотидной последовательностью.

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) - полимеразная цепная реакция с использованием одного декануклеотидного праймера с произвольной нуклеотидной последовательностью [30, 31, 69, 70]. Продукт RAPD образуется в результате амплификации фрагмента геномной ДНК, фланкированной инвертированной последовательностью данного праймера. Метод удобен для исследований разных видов при использовании одних и тех же праймеров. Основной проблемой этого метода является его чувствительность к изменениям условий реакции (буфер, полимераза и концентрации компонентов реакции) и даже характеристик амплификатора (уменьшенная стабильность условий, например при отсутствии термостатированной крышки). Температура реакции отжига достаточно низкая (37°С), что увеличивает вероятность образования продуктов амплификации (ампликонов) с большим количеством неспаренных оснований (ошибки отжига).

В качестве МГМ необходимо учитывать только наиболее четкие и хорошо воспроизводящиеся (при повторной амплификации) продукты ПЦР. Нельзя использовать в анализе ампликоны, плохо различимые при электрофорезе. Яркие полосы образуются в результате амплификации фрагментов, фланги которых полностью комплементарны последовательности праймера, а тусклые - в результате ошибок отжига праймера. Чем больше таких ошибок, тем хуже амплифицируются RAPD-продукты и тем сложнее воспроизводить их при изменении условий реакции. Обычно праймеры, использование которых позволяет выявлять межсортовую дифференциацию у одного вида растений, оказываются эффективными для выявления межсортовых различий и у сортов близкородственного и даже дальнего вида.

Однако RAPD-технология имеет ряд недостатков. Во-первых, в зависимости от праймеров и условий реакции не всегда воспроизводятся результаты ПЦР [61], а во-вторых, RAPD-маркеры, как правило, ведут себя как доминантные, и их гетерозиготное состояние не отличается от гомозиготного. Это не исключает применения RAPD-технологии в популяционном анализе и при идентификации генетических ресурсов, но при этом точность оценок по сравнению с кодоминантными маркерами снижается.

Специальные исследования возможностей метода привели к весьма важному выводу: для того чтобы уровень статистической достоверности данных, полученных при RAPD-анализе, соответствовал таковому при использовании кодоминантных маркеров, необходима в 2—10 раз большая выборка исследованных организмов [72]. К основным свойствам RAPD можно отнести следующие: доминантный тип наследования (присутствие-отсутствие); относительно низкая точность (праймер в 10 нуклеотидов может давать такой же спектр ампликонов, как и праймер в 15 или 8 нуклеотидов [30, 31]); зависимость от характеристик амплификатора (для большинства амплификаторов максимальная длина амплифицируемого фрагмента - 2500-3500 пар нуклеотидов); локализация в геноме полученных фрагментов неизвестна; функция неизвестна [3, 31, 43, 44, 72].

Проблема широкого использования RAPD связана исключительно с особенностью произвольных праймеров в ПЦР. Далеко не каждая нуклеотидная последовательность может использоваться как праймер в ПЦР и не каждая последовательность встречается в геноме с высокой частотой в инвертированном состоянии и "удобной" для ПЦР. Повышая температуру отжига до 55°С и выше (даже для 10-членных праймеров), подбирая более "качественную" последовательность праймеров в отношении их размеров (15—18 нуклеотидов) и уменьшения потенциальных ошибок отжига, можно существенно улучшить воспроизводимость спектров продуктов амплификации в RAPD [22].

Начиная с 1990 г. метод RAPD активно используется, в частности в генетике растений - для некоторых из видов растений с его помощью построены генетические карты. Как правило, исследования с использованием RAPD выполняются следующим образом: из большого количества декануклеотидов эмпирическим путем подбираются такие "десятки", которые дают у данного объекта исследований наиболее легко типируемые продукты амплификации, воспроизводящиеся при повторных исследованиях ДНК, несколько раз выделенной из одного и того же источника, т.е. подбираются из имеющихся наиболее удобные праймеры. Причем для решения некоторых задач, например генетической паспортизации особей или сортов, удобнее подбирать праймеры с большим количеством ампликонов, для межвидовых сравнений - с более простым спектром продуктов амплификации. И если практическая значимость использования RAPD внутри вида как высокополиморфных молекулярно-генетических маркеров анонимных последовательностей ДНК очевидна, то их привлечение к решению проблем генетических взаимосвязей между различными группами организмов остается достаточно спорным до сих пор. Накапливаются данные о том, что, как и в случае использования электрофоретических вариантов белков, микросателлитных локусов, оценки генетических расстояний с привлечением RAPD маркеров могут существенно варьировать от локуса к локусу, от таксона к таксону [6].

ISSR. Улучшение метода RAPD достигается с помощью увеличения точности отжига (увеличения длины праймера) и уменьшения его "случайности" - анонимности. К одному из таких методов относится использование ISSR-маркеров (Inter-Simple Sequence Repeat). В этом методе, также как и в RAPD, используется один или несколько праймеров длиной 15-24 нуклеотида [23, 74]. Но в данном случае праймеры состоят из тандемных коротких 2-4 нуклеотидных повторов, например 5' - СА СА СА СА СА СА СА СА СA G -3' и одного селективного нуклеотида на З'-конце праймера [3, 5]. Продукты ISSR-амплификации содержат на флангах инвертированную микросателлитную последовательность праймера. Так как в данном методе последовательность праймеров специфична и подбирается более строго, чем в RAPD, фингерпринт обычно лучше воспроизводим [40, 58]. Проблема "сильных" и "слабых" ампликонов остается, но уже в меньшей степени. Необходимо подбирать последовательность ISSR-праймеров более строго и использовать в анализе только "яркие" продукты ISSR-амплификации. Выявляемый полиморфизм с помощью ISSR, как правило, выше и более четко воспроизводим, чем в RAPD [4, 49].

В геномах растений и животных количество микросателлитных повторов очень велико, что делает этот метод удобным для генетического анализа. Микросателлитные последовательности окружают многие гены и могут использоваться как якорные последовательности к этим генам. Как и RAPD, ISSR не требует предварительного клонирования и секвенирования фрагментов для подбора праймеров. Этот метод начал развиваться в 1994 г., а к настоящему времени получил широкое распространение, особенно в исследованиях генофондов различных видов растений [4, 49]. К основным свойствам ISSR относятся: доминантный тип наследования; относительно высокая точность и улучшенная воспроизводимость по сравнению с RAPD в связи с большей длиной праймера (19-23 пары нуклеотидов) и более высокой температурой отжига. Однако локализация продуктов амплификации в геноме, так же как и их функция, остаются неизвестными. Предполагается их относительно равномерное распределение по длине генома, как и микросателлитных локусов. Количество ампликонов при использовании динуклеотидного микросателлитного повтора в качестве праймера должно быть больше, чем при использовании тринуклеотидного повтора. Спектр должен существенно отличаться между таксонами в зависимости от преобладания в них отдельных вариантов микросателлитных локусов. Предполагается также, что изменчивость спектра ампликонов при использовании ISSR-маркеров не зависит от факторов отбора, событий эволюционного ранга, а связана только со временем расхождения между группами организмов.

AFLP. Технология AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) представляет собой нечто промежуточное между ПДРФ- и RAPD-анализом. AFLP - сложный метод и состоит из нескольких этапов: геномная ДНК рестрицируется двумя рестриктазами (как правило, EcoRI и MseI) с образованием фрагментов с выступающими ("липкими") 3'-концами. Затем рестрицированная геномная ДНК лигируется с адаптером, содержащим "липкие" концы для данных рестрикционных сайтов. После этого проводятся две последовательные ПЦР [64, 67]. В первой (преамплификация) используются праймеры, полностью комплементарные адаптерам EcoRI и Msel. После первой ПЦР образуется большое количество продуктов амплификации между адаптерами EcoRI и Msel, которые невозможно дифференцировать с помощью электрофореза. Поэтому во второй ПЦР праймеры с адаптерами EcoRI и MseI содержат на 3'-конце дополнительные и некомплементарные адаптерам основания (от 1 до 3) для селективной амплификации. Разделение фрагментов ДНК выполняется в полиакриламидном геле с радиоактивной или флуоресцентной меткой.

Получаемый фингерпринт ДНК обычно высокополиморфен и, как правило, хорошо воспроизводим. Однако AFLP-маркерная система, как и RAPD, является все же в основном доминантной по типу наследования аллельных вариантов. Идентичность в гелях амплифицированных неполиморфных ДНК-фрагментов одной и той же длины часто недоказуема. Полиморфизм AFLP выше, чем RAPD и ISSR. Эта технология позволяет определять генетические изменения, вызванные точечными мутациями в сайтах рестрикции или в участках отжига праймеров (присутствие или отсутствие продукта амплификации в спектре) и небольшими вставками-делециями внутри рестрикционного фрагмента (изменение размера полосы в спектре).

Этот метод получил широкое распространение, однако остается сравнительно дорогим и сложным. Малейшие изменения на каждом этапе приводят к "ложному" полиморфизму и ошибочной трактовке результатов. МГМ, выявленные методом AFLP, легко картируются на хромосомах, однако многие из них локализуются в центромерных и гетерохроматиновых районах хромосом, по-видимому, в связи с неравновероятным распределением сайтов узнавания используемых рестриктаз.

SSR (Simple Sequence Repeats) - метод ПЦР с фланкирующими праймерами к короткому мини- или микросателлитному повтору позволяет выявлять маркеры с кодоминантным наследованием и, соответственно, удобен для выявления гетерозигот по данному локусу. Однако одна пара праймеров для флангов в ПЦР позволяет рассматривать полиморфизм только одного локуса. Для многих микросателлитных локусов не удается выявить полиморфизм. Как правило, фланкирующие последовательности для данного микросателлитного локуса оказываются видоспецифичными. Вместе с тем природа фрагмента, полиморфизм которого изучается, известна, т.е. нет неопределенности, характерной для фрагментов, выявляемых RAPD- и AFLP-методами, или для случайных проб ПДРФ.

К основным свойствам микросателлитных локусов можно отнести сложный характер распределения по генам. Так, имеются таксономические предпочтения в распространении разных повторов, в частности для растений типично преобладание АТ-повтора, для млекопитающих - СА-повтора, у человека предположительно 50 000 микросателлитных локусов на геном - 1 на 30 тысяч пар оснований, у арабидопсиса - 1 на 430 тысяч пар оснований (в 14 раз реже). Для их выявления необходимы праймеры к флангам микросателлитного локуса. Аллельные варианты микросателлитного локуса оцениваются как продукты амплификации разной длины (разное количество повторов) при использовании пары праймеров к его флангам. Для таких локусов типичен высокий уровень полиморфизма (мутируют в 1000 раз чаще, чем структурные гены) и наличие специфических механизмов возникновения аллельных вариантов (ошибки репликации, ошибки кроссинговера). По микросателлитным локусам обнаруживается высокий уровень гетерозиготности [12].

ДНК-фингерпринт с помощью ретротранспозонов. В настоящее время методы RAPD, ISSR, AFLP и SSR легли в основу создания новых типов МГМ, использующих последовательности ретротранспозонов для анализа геномов.

На основе RAPD при использовании в качестве праймеров коротких последовательностей ретротранспозонов возник метод IRAP. ISSR получил свое продолжение в REMAP, в котором используются оба варианта праймеров - из ретротранспозона и микросателлита. AFLP привел к возникновению боле-специализированного метода, основанного на последовательностях ретро транспозонов - SSAP. И, наконец, полиморфизм микросателлитных локусов, SSR, с использованием локус-специфичных праймеров к флангам микросателлитного повтора привел к развитию метода RBIP, в котором используют праймеры, фланкирующие сайты ретротранспозиции. Такого развития этих методов можно было ожидать, поскольку в большинстве продуктов RAPD-, ISSR- и AFLP -амплификации обнаруживались последовательности, соответствующие ретротранспозонам.

Ретротранспозоны — мобильные генетические элементы, широко представленные в геномах всего царства эукариот и составляющие огромную часть геномной ДНК (до половины генома у растений) [47]. Они распространяются по всем геномам и локализуются во всех хромосомах. Большая часть ретротранспозиции, как правило, локализуется в сами ретротранспозоны или другие повторы (последовательности "AF254799" GenBank) [39, 62, 63]. Ретротранспозоны используют как промежуточный этап жизненного цикла копирование своей РНК в ДНК с помощью обратной транскрипции и фермента Rnase H в копию ДНК, которая встраивается в ДНК хозяина с помощью интегразы IN (рис. 1). Новые ретротранспозиции в геноме хозяина в зависимости от локализации могут приводить к изменениям активности генов, как положительным, так и отрицательным [32, 41], и даже индуцировать хромосомные изменения. Длинные концевые повторы (LTR) ретротранспозонов несут регуляторные сайты, опознаваемые некоторыми ядерными факторами [66].

К настоящему времени геномы ряда эукариот, в том числе и человека, полностью секвенированы [38]. Оказалось, что большая часть исследованных геномов представлена различными типами повторов, существенный вклад в которые вносят ретротранспозоны. Например, в геноме человека только 5 % генома образуют последовательности, кодирующие РНК и белки, более 50 % генома состоят из повторов, основную часть которых составляют ретротранспозоны - длинные диспергированные повторы (Long Interspersed Elements, LINE) (21 %), короткие диспергированные повторы (Short Interspersed Elements, SINE) (13 %) и LTR — ретровирусподобные элементы (8 %) [38]. Для растений характерна сходная картина: более половины генома составляют ретротранспозирующие элементы. Очевидно, что такая их представленность в геномах позволяет широко использовать эти последовательности в качестве МГМ.

В случае МГМ на основе ретротранспозонов их полиморфизм связан с уникальным биологическим процессом ретротранспозицией в результате встраивания ретротранспозона в новый участок геномной ДНК без потери первоначального участка в ней. Ретротранспозиция может вовлекать в себя от нескольких сотен нуклеотидов до нескольких тысяч, она необратима, что облегчает наблюдение и использование этого процесса. Кроме того, насчитывается до десятка тысяч копий на геном для некоторых ретротранспозонов [47], причем потенциально каждая копия может быть использована как МГМ.

Метод SSAP (Sequence Specific Amplification Polymorphism) явился модификацией метода AFLP. Принцип SSAP состоит в следующем [37, 68]. ДНК исследуемых образцов расщепляется рестриктазами PstI и Msel, образуя фрагменты с выступающими 3'-концами. Затем рестрицированная ДНК лигируется с PstI- и Msel-адаптерами. Первая ПЦР (преамплификация) проводится с праймерами от PstI- и Msel-адапторов, т.е. амплифицируются все возможные комбинации сочетания этих адаптеров в рестрицированной геномной ДНК. После первой ПЦР образуется большое количество продуктов амплификации фрагментов ДНК, локализованных между праймерами и адаптерами. ПЦР-продукты разбавляются и используются для второй, селективной ПЦР, которая проводится с меченым праймером к LTR и любым праймером адаптеров либо с PstI или MseI. Во второй ПЦР можно использовать праймеры к адаптеру с дополнительными нуклеотидами на 3'-конце, например один, два или три нуклеотида, некомплементарные адаптеру. Электрофорез после второй ПЦР проводят в полиакриламидном геле или в секвенаторе, если используется флуоресцентная метка. Продукты амплификации после второй ПЦР образуются в результате амплификации фрагмента ДНК между LTR и адаптером. Получение продуктов амплификации между только LTR-последовательностями принципиально возможно, но, как правило, расстояние между двумя ретротранспозонами длиннее обычно получаемых ПЦР-продуктов (2,5-3,0 тысячи пар оснований). А продукты амплификации между адаптерами не будут выявляться, поскольку используется метка только для LTR-праймера.

К достоинствам метода относится высокий уровень полиморфизма и хорошая, стабильная воспроизводимость спектров продуктов амплификации. Полиморфизм, выявляемый SSAP, выше, чем при использовании метода AFLP на одних и тех же исследуемых образцах.

Этот метод имеет те же недостатки, что и AFLP. К ним относится его многоступенчатость и технические трудности, связанные с этим. Метод требует привлечения дорогих реактивов и приборов. В случае неполной рестрикции геномной ДНК (необходимо высокое качество выделенной ДНК образца) и/или лигирования адаптеров возможно возникновение ложного полиморфизма.

Полиморфизм SSAP-маркеров может быть обусловлен как событиями ретротранспозии, так и точечными мутациями в области рестрикции или в комплементарной последовательности LTR-праймера. Поэтому невозможно быть уверенным в том, что "появление" или "исчезновение" продукта амплификации в образце обусловлено ретротранспозицией.

IRAP и REMAP. Следующие два новых и простых метода - IRAP (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) и REMAP (Retrotransposon-Microsatellite Amplified Polymorphism) [40]. IRAP - полимеразная цепная реакция между праймерами, комплементарными последовательностями двух рядом расположенных LTR ретротранспозона.

Метод имеет несколько вариантов. В первом используется единичный праймер из LTR. Продукты амплификации образуются между двумя инвертированными LTR с одинаковой последовательностью, т.е. в одной цепи 5'-конец одного LTR ориентирован к 3'-концу другого. Если центральная часть ретротранспозона длиннее обычных ПЦР-продуктов (около 3 тысяч пар оснований), то ПЦР пройдет только между двумя LTR из разных ретротранспозиций. В этом случае соседние LTR должны располагаться в инвертированном положении. В другом варианте IRAP используются два разных праймера к инвертированным LTR: один с 5'-конца, а другой - с 3'-конца LTR, ориентированные в разные стороны от ретротранспозона. В данном случае соседние LTR располагаются как прямые длинные повторы. И наконец, в третьем варианте IRAP используются праймеры к LTR из разных ретротранспозонов в различной ориентации.

REMAP — полимеразная цепная реакция между праймером к фрагменту LTR ретротранспозона и праймером из рядом расположенного простого микросателлитного повтора (SSR-праймер). В данном случае позиция амплифицируемого фрагмента ретротранспозона "заякоривается" путем использования праймера к микросателлитному локусу. Например, у растений удобным оказывается использование праймера к LTR и праймера к микросателлиту (5' - СА СА СА СА СА СА СА СА СА СА G -3') с единичным селективным нуклеотидом на 3'-конце праймера. В REMAP применяют варианты LTR-праймеров как для 5'-, так и для 3'-конца LTR, как и в IRAP.

К достоинствам этих двух методов относятся их относительная простота и потенциально большое количество комбинаций праймеров из различных ретротранспозонов и микросателлитов (REMAP). Поскольку в геномах растений и животных выявляют большое количество ретротранспозонов, потенциальная информативность (количество локусов и их полиморфизм) методов IRAP и REMAP очень велика. Последовательности праймеров к LTR подбираются из консервативных и концевых участков LTR. Большинство LTR на 5'- и 3'-концах имеют консервативные последовательности, необходимые для ретротранспозиции. В основном праймеры подбираются к концам LTR таким образом, чтобы амплифицированные продукты были достаточно удобны для ПЦР и электрофореза. Представляется возможность использовать праймеры к различным консервативным участкам LTR или центральной, кодирующей части ретротранспозона, поскольку в геномах присутствует большое количество неполноценных ретротранспозонных последовательностей, образованных, в частности, вследствие рекомбинации геномной ДНК.

Очень важный аспект получения всех МГМ, основанных на ПЦР, это воспроизводимость фингерпринтов. В этой связи особую важность приобретает подбор праймеров и условия ПЦР. В обоих методах, IRAP и REMAP, используются праймеры, полученные к последовательностям после "выравнивания" нескольких последовательностей одного типа LTR, и к наиболее длинным, полностью комплементарным участкам подбираются высокоспецифичные праймеры с высокой температурой плавления. Подбор праймеров к консервативным участкам LTR увеличивает количество ампликонов и позволяет уменьшить вероятность выявления полиморфизма, обусловленного точечными заменами в последовательностях, комплементарных праймеру, и способствовать выявлению истинных транспозиций. Поскольку праймеры подбираются к наиболее консервативным участкам LTR, то праймеры к LTR одного вида, как правило, подходят для анализа МГМ близкородственных видов, а в некоторых случаях, в зависимости от типа ретротранспозона, - даже для удаленных видов. Обычно для этого типа МГМ характерны достаточно жесткие условия ПЦР - высокая температура отжига (от 60 до 68 °С).

Получаемый полиморфизм продуктов амплификации с помощью IRAP и REMAP не уступает SSAP, но оба метода несравнимо проще и удобней, чем SSAP и AFLP. Новые продукты амплификации при IRAP образуются в результате переноса одного ретротранспозона в позицию, расположенную рядом с другим. Они могут принадлежать одному и тому же ретротранспозону или разным. Последовательность между ретротранспозонами может быть представлена, в свою очередь, последовательностью другого ретротранспозона, может быть кодирующей последовательностью или некодирующей (если продукт амплификации IRAP короткий, до 1000 пар оснований, то, скорее всего, это продукт амплификации некодирующей последовательности). Большинство транспозиций происходит в повторы, и, как правило, в другие ретротранспозоны [54, 59].

Некоторые ретротранспозоны относительно равномерно распределяются по длине генома, это, в частности, BARE-1. Это показано с помощью гибридизации in situ с пробами из LTR и кодирующей части ретротранспозона. Некоторые короткие ретротранспозоны, как MITE, достаточно часто локализуются вблизи кодирующих последовательностей [59].

Вместе с тем продукты REMAP-амплификации фланкируются микросателлитной последовательностью. Известно, что микросателлиты располагаются как вблизи генов, так и в некодирующей ДНК. Поэтому МГМ REMAP могут иметь более широкое применение, чем IRAP, поскольку выше вероятность того, что продукты REMAP-амплификации не кластеризуются в участках хромосом, где повышенное количество повторов, а равномернее распределяются по хромосомам.

RBIP. В методах SSAP, IRAP и REMAP рассматриваются МГМ, которые, как правило, имеют доминантный характер наследования продуктов амплификации, поскольку их наличие не позволяет отличать гомозиготу от гетерозиготы. Разработан еще один метод, основанный на использовании праймеров к последовательностям ретротранспозонов - RBIP (Retrotransposon-Based Insertion Polymorphisms). Этот метод позволяет исследовать кодоминантные аллельные варианты [12]. Его принцип основан на мультилокусной ПЦР, в которой используются пара праймеров, фланкирующих участок ДНК до ретротранспозиции, и праймер к LTR-ретротранспозона, встроенный в данный участок между первыми двумя праймерами. В результате ПЦР будет амплифицироваться один из вариантов фрагментов, фланкированных парой праймеров, поскольку последовательность между LTR слишком длинная для ПЦР между сайтами геномной ДНК с ретротранспозоном внутри. Этот метод выявляет полиморфизм только для данного локуса. К его достоинствам относят кодоминантность полиморфных вариантов, возможность использования для дот-блот анализа большого количества сортов. Главный же недостаток - необходимо клонирование и секвенирование последовательностей участка ДНК до и после ретротранспозиции. Это относительно сложная и дорогостоящая процедура. Возможно ее облегчение, например секвенирование полиморфных продуктов ПЦР после IRAP, REMAP или SSAP, и использование затем инвертной ПЦР для полиморфного участка полиморфного продукта. Но инвертная ПЦР также является достаточно трудоемким процессом, требующим дополнительного анализа клонов, их секвенирования и проверочной ПЦР.

Другой теоретически возможный подход к выявлению полиморфизма фрагментов ДНК, в которых локализуются последовательности ретротранспозонов, основан на использовании метода "CODE" для клонирования делетированных фрагментов ДНК [71]. В данном случае будет создана библиотека участков ДНК, в которые произошла ретротранспозиция. Этот подход состоит из нескольких этапов, но позволяет сразу получить большое количество фрагментов геномной ДНК, в которых локализованы ретротранспозоны, и оценить их полиморфизм. Геномные ДНК исследуемого сорта или линий и сравниваемой (контрольной) формы рестрицируются тремя рестриктазами BamHI, BglII и BelI. Рестрицированная ДНК лигируется со специфическими адаптерами. ДНК из контрольной формы амплифицируют с dUTP и немодифицированными праймерами к адаптерам. А ДНК из исследуемой формы амплифицируют с биотинилированными праймерами к адаптерам с обычными трифосфонуклеотидами (dNTP). Продукты амплификации (размером не более 2000 пар оснований) денатурируют и гибридизуют. И затем обрабатывают урацил-ДНК-гликозилазой, чтобы полностью разрушить фрагменты ДНК из контрольной формы, а также с помощью S1 нуклеазы из проростка золотистой фасоли, чтобы разрушить все гетерогенные гибриды. Остаются только полноценные гибриды исследуемой ДНК. Эта процедура повторяется 3 раза. Затем фрагменты ДНК амплифицируют, клонируют в плазмидном векторе и секвенируют. Далее проводится ПЦР фрагмента между праймером к LTR и праймерами, полученными из этих клонов к ДНК из исследуемой формы. Если образуется продукт амплификации, из этого следует, что найдена ретротранспозиция. RBIP-метод удобен для анализа гетерозиготных популяций, так как будут амплифицироваться оба аллеля данного локуса. Метод имеет перспективу, но дорог и трудоемок.

В заключение можно сказать, что генетический полиморфизм, выявляемый с помощью молекулярных маркеров, является центральным звеном в современном генетическом анализе. Как правило, внутри каждого типа МГМ отдельные локусы существенно отличаются друг от друга по полиморфизму, сложности и воспроизводимости их выявления. Решение каждой конкретной задачи требует подбора оптимальных молекулярно-генетических маркеров.