Аллергические методы диагностики туляремии

Аллергические методы диагностики туляремии основываются на особенностях организма человека, заболевшего или переболевшего туляремией, отвечать местной аллергической реакцией в виде гиперемии и инфильтрата на введение туляремийного антигена (тулярина). У больных туляремией людей кожная аллергическая реакция становится положительной обычно с 3-5-х суток болезни, реже в более поздние сроки, и сохраняется многие годы, благодаря чему аллергический метод служит для ранней или ретроспективной диагностики туляремии и является строго специфичным. У привитых живой вакциной также возникает аллергическая реактивность, но она развивается медленнее (через 10-15 дней после вакцинации) и удерживается 5-6 лет, иногда дольше. Реакция аллергии может служить методом для определения сохранности вакцинального иммунитета.

Аллергическую пробу ставят как накожно, так и внутрикожно с соответствующим тулярином

Внутрикожная проба с тулярином

Для внутрикожной пробы применяют тулярин – взвесь туляремийных бактерий вакцинного штамма, убитых нагреванием при 70ºС в течение 1 часа. Взвесь готовят в физиологическом растворе, содержащем 3% глицерина. В 1 мл препарата содержится 500 млн. убитых бактерий. Выпускают препарат в запаянных ампулах, содержащих 1мл препарата, что составляет 10 человеко-доз. Препарат предназначен в первую очередь для диагностики туляремии.

Техника постановки реакции. Тулярин в количестве 0,1 мл вводят стерильным шприцем с тонкой иглой (с коротким срезом) строго внутрь кожи левого предплечья (на границе верхней и средней трети). Кожу предплечья предварительно обрабатывают спиртом или эфиром. На месте введения препарата образуется беловатый пузырек диаметром 3-4 мм, который через полчаса рассасывается.

Учет и оценка реакции. Учет реакции производят через 24-48 часов путем осмотра и ощупывания участка кожи, куда был введен тулярин. При положительной реакции на месте введения тулярина уже через 6-10 часов обнаруживается покраснение (гиперемия) и отек (инфильтрат). Через 24 часа реакция кожи выражена вполне отчетливо и имеет вид гиперемированного, нередко болезненного инфильтрата. Реакцию считают положительной при наличии инфильтрата и гиперемии диаметром не менее 0,5 см. Интенсивность реакции на тулярин определяют по величине реагирующего участка (отека и гиперемии) кожи, который измеряют в сантиметрах в двух взаимоперпендикулярных направления. Изменения кожи в виде гиперемии без инфильтрата, исчезающей через 48 часов, расценивают как отрицательный результат. Сомнительной реакцию считают, если через 24 часа на месте введения тулярина имеется лишь незначительное покраснение и инфильтрат кожи диаметром менее 0,5 см.

В сомнительных и подозрительных случаях необходима повторная постановка реакции, так как отрицательный результат мог быть обусловлен ранним сроком постановки реакции. Так, реакция аллергии может запаздывать при легочной форме туляремии. Запаздывание реакции возможно также при раннем применении антибиотиков для лечения больного. В ряде случаев аллергическая реакция сопровождается образованием пустулы или кратковременным лимфангоитом и ощущением некоторой болезненности с незначительным увеличением регионарных лимфатических узлов и даже повышением температуры тела на 1-1,5ºС в течение 1-2 дней. Известны случаи описания некроза на месте инъекции тулярина. Наиболее интенсивные реакции наблюдаются у лиц, перенесших туляремию, особенно при обследовании их вскоре после болезни. [15]

Накожная проба с тулярином

Для накожной пробы применяют тулярин – взвесь туляремийных бактерий вакцинного штамма, убитых нагреванием при 70ºС в течение 1 часа. Взвесь готовят в физиологическом растворе, содержащем 3% глицерина. В 1 мл препарата содержится 10 млрд. убитых бактерий. Выпускают препарат в запаянных ампулах, содержащих 1 мл, что составляет 20 человеко-доз. Препарат предназначен в первую очередь для определения иммунитете у привитых против туляремии или для анамнестического обследования.

Техника постановки реакции. Перед употреблением ампулу с накожным тулярином встряхивают до образования равномерной взвеси. Одну каплю тулярина глазной пипеткой наносят на тщательно обработанную спиртом и эфиром кожу наружной поверхности левого плеча в его средней трети. Через каплю стерильным оспопрививательным пером делают две параллельные насечки длиной 8-10 мм, соблюдая расстояние между насечками 5мм, до появления росинок крови. Затем тулярин тщательно втирают в насечки плоской стороной оспопрививательного пера непродолжительное время (до 1 минуты). Оспопрививательное перо после каждой пробы обеззараживают спиртом, а затем обжигают на пламени или кипятят. Тулярин применяют немедленно после вскрытия ампулы.

Учет и оценка реакции производят через 48-72 часа путем осмотра и измерения поперек сделанных насечек отечности и красноты кожи в сантиметрах. Положительная реакция выражается отечностью кожи вокруг насечек и краснотой, которые иногда появляются уже через 24 часа после введения тулярина, через 48-72 часа реакция обычно ярко выражена и далее постепенно угасает, исчезая полностью к 7-10-12 дню. Диаметр реагирующего участка кожи достигает 1-2 см. В редких случаях по ходу насечек появляются везикулы, исчезающие через 2-3 дня. Для оценки интенсивности реагирующий участок кожи, определяемый по границе красноты, измеряют по поперечнику сделанных насечек. Реакцию считают положительной при величине реагирующего участка кожи не менее 0,5 см или наличии вдоль насечек ясного покраснения или небольшой отечности (валик). При правильной постановке накожная туляриновая проба по чувствительности не уступает внутрикожной но, в отличие от последней, не сопровождается повышенными местными или общими реакциями. Категорически запрещается накожный тулярин вводить внутрикожно или подкожно, так как он вызывает бурную местную и общую реакцию. [15]

Реакция лизиса лейкоцитов

Реакция лейкоцитолиза основана на явлении разрушения лейкоцитов в сенсибилизированном организме под действием специфического антигена. РЛЛ используется при лабораторной диагностике туляремии у человека, так как она становиться положительной уже к 3-4 дню заболевания. Кроме того, она может быть использована для оценки напряженности иммунитета у вакцинированных против туляремии, а также при ретроспективном исследовании.

Техника постановки реакции лизиса лейкоцитов. В две лунки полистироловой пластины вносят 0,1мл исследуемой крови. Предварительно в 1 лунку вносят взвесь убитых прогреванием (70⁰ С, 1 час) туляремийных микробов в концентрации 10 млрд.м.к/мл или тулярина для накожного применения в 5 % растворе цитрата натрия, а во вторую лунку (контроль) предварительно вносят 0,1 мл 5 % цитрата натрия. Пластинку помещают на 2 часа в термостат при 37⁰С. Затем по 0,02 мл из каждой лунки переносят в соответствующие лунки, содержащие 0,4 мл 3 % уксусной кислоты, подкрашенной до светло-голубого цвета метиленовой синькой. Количество лейкоцитов подсчитывают в камере Горяева без учета разрушенных или собравшихся в кучки клеток. Наличие лейкоцитов после инкубации в опытной и контрольной пробирках подсчитывается по формуле: количество лейкоцитов после инкубации х100% количество лейкоцитов до инкубации.

Показатель специфического лизиса лейкоцитов (ПСЛ) подсчитывается путем определения разницы – процент уменьшения лейкоцитов в опытной пробирке минус процент уменьшения лейкоцитов в контроле. ПСЛ выражается отрицательной величиной и колеблется в пределах от -10 до -30%. ПСЛ меньше - 10% свидетельствует о неспецифическом лизисе. [15]

 

Заключение

Бруцеллез – антропозоонозное инфекционное заболевание человека и животных, вызванное микроорганизмами рода Brucella, которое передается контактным путем от животных (крупного рогатого скота, овец, коз, свиней, кролей, оленей) или через инфицированные продукты. Заболевание может переходить в хроническуюформу с поражением органов опорно-двигательного аппарата, нервной и мочеполовой систем организма.

Организм человека – эпидемиологический тупик. Инфицирование происходит преимущественно алиментарным путем, реже контактным или аэрогенным.

Туляремия – инфекционная болезнь, вызываемая бактериями рода Francisella, характеризующаяся воспалительными изменениями в области ворот инфекции, регионарным лимфаденитом, лихорадкой, симптомами общей интоксикации и склонностью к затяжному течению. Относится к зоонозам с природной очаговостью.

Человек заражается при прямом или непрямом контакте с грызунами, алиментарным, транмиссивным и воздушно-пылевым путем.

Материалом для исследования в диагностике бруцеллеза является преимущественно кровь, а также желчь, моча, мокрота, спинномозговая жидкость; в диагностике туляремии – пунктат бубона, пленка из зева, гнойное отделяемое конъюнктивы, мокрота, испражнения.

Для лабораторной диагностики бруцеллеза и туляремии у людей применяются три группы методов: первая – тесты, позволяющие выявить возбудитель заболевания и его растворимые антигены; вторая – методы определения специфических антител; третья – тесты, выявляющие сенсибилизацию организма к бруцеллезным и туляремийным антигенам.

Основными являются бактериологический и серологические грппы методов. Большие перспективы в диагностике этих инфекций открывают молекулярно-генетические методы, и, в частности, метод ПЦР, позволяющий выявить всего несколько копий ДНК возбудителей в биологическом материале. Особое место в ранней диагностике этих антропозоонозов занимают кожные аллергические методы.

Цель дипломной работы достигнута, рассмотрены наиболее информативные и эффективные методики лабораторной диагностики (ООИ).

В соответствии с поставленной целью, были решены основные задачи дипломной работы:

Задачи дипломной работы:

1. проведен обзор литературных данных по теме дипломной работы;

2. изучены морфологические и биологические характеристики возбудителей бруцеллеза и туляремии;

3. рассмотрен и сравнен комплекс методов лабораторной диагностики бруцеллеза и туляремии;

Из всего вышесказанного сделаны основные выводы по дипломной работе:

1. Бруцеллез и туляремия – это особо опасные инфекции (ООИ), которые могут возникать среди населения в виде отдельных заболеваний, эпидемий и даже пандемий, характеризующиеся природной очаговостью, быстрым распространением и тяжелым течением.

2. При выявлении больного, подозрительного на заболевание ООИ, все первичные противоэпидемические мероприятия проводятся при установлении предварительного диагноза на основании клинико-эпидемиологических данных. При установлении окончательного диагноза мероприятия по локализации и ликвидации очагов особо опасных инфекций осуществляются в соответствие с действующими приказами и инструктивно-методическими указаниями по каждой нозологической форме.

3. Комплексное направление ускоренной идентификации патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов, использующее методы экспресс-индикации, основанные на интеграции различных принципов, связано с разработкой и созданием индикаторных тест-систем, позволяющих в течение короткого срока и с минимальными затратами на анализ определить комплекс основных признаков патогена или санитарно-показательного представителя, достаточных для его идентификации до рода, вида и даже типа.

Опираясь на выводы, были сделаны следующие рекомендации:

- более активно проводить санитарно-просветительную работу среди населения с целью предупреждения заражения бруцеллезом и туляремией;

- внедрять в практику работы клинико-диагностических лабораторий лечебно-профилактических учреждений современные высокоэффективные методы диагностики этих зооантропонозных инфекций.

 

 

Список использованной литературы

 

1. Ананьина Ю. В. Природноочаговые бактериальные зоонозы: современные тенденции эпидемического проявления / Ю. В. Ананьина // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. – 2012. – № 6. – С.86-90.

2. Желудков М. М. Бруцеллез в России: современная эпидемиология и лабораторная диагностика / М. М. Желудков // Дис. на соиск. ст. д-ра мед. наук. – спец: 14.00.30 эпидемиология. – 2013. – 263 с.

3. Инфекционные болезни / К. В. Жданов, С. М. Захаренко, Ю. П. Финогеев, Ю. А. Винакмен. – СПб.: Диля, 2015. – 528 с.

4. Инфекционные болезни. Учебник / Н. Д. Ющук, Г. Н. Кареткина, Л. И. Мельникова. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2014. – 512 с.

5. Инфекционные болезни: справочник / С. Г. Пак, Б. К. Данилкин, Е. В. Волчкова, М. Н. Алленов. – ООО Медицинское информационное агенство. – 2012. – 368с.

6. Инфекционные болезни: учебник / Е. П. Шувалова, Е. С. Белозеров, Т. В. Беляева, Е. И. Змушко. – СПб.: СпецЛит, 2015. – 736 с.

7. Коротяев А. И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология / А. И. Коротяев, С. А. Бабичев. – СПб.: СпецЛит, 2012. – 767 с.

8. Красноженов Е. П. Микробиологическая диагностика инфекционных заболеваний. – М.:Феникс. –2016. – 280 с.

9. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: в 2-х тт. – Т. 2: учеб. по дисциплине «Микробиология, вирусология и иммунология» для студентов учреждений высш. проф. образования / под ред. В. В. Зверева, М. Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. –480 с.

10. Методики клинических лабораторных исследований: справ. пособ. Т3. Клиническая микробиология. Бактериологические исследования. Микологические исследования. Инфекционная иммунодиагностика. Молекулярные исследования в диагностике инфекционных заболеваний / под ред. В. В. Меньшикова. – М.: Лабора, 2012. – 880 с.

11. Микробиологическая диагностика бактериальных инфекций: учеб. пособ. / под ред. М. В. Ждановского, И. М. Щукина, О. А. Слюсарева. – Донецк.: Дон НУЕТ, 2017. – 274 с.

12. Микробиология / А. А. Воробьев, А. С. Быков, Е. П. Пашков, А. М. Рыбакова. – М.: Академия, 2016. – 340 с.

13. МУ 3.1.2007-05 Эпидемиологический надзор за туляремией// Бюллетень нормативных и методических документов госсанэпиднадзора №4 (22). – 2015. – 48 с

14. МУ 3.1.7.1189-03 от 30.01.2003 Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей. – М.:МР, 2013 – 49 с.

15. МУ 4.2.10-19-84-2005 «Лабораторная диагностика туляремии у людей и выделение возбудителя туляремии из объектов внешней среды». – М.:МР, 2013– 39 с.

16. МУК 4.2.3010-12 Порядок организации и проведения лабораторной диагностики бруцеллеза для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней. – М.: 2013. – 44 с.

17. О состояниисанитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2015 году: Государственный доклад. – М.:Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2016. – 200 с.

18. О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2014 году»: Государственный доклад. – М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2015. – 206 с.

19. Письмо Роспотребнадзора от 22.02.2017 № 01/2370-17-32. Об эпизоотолого-эпидемиологической ситуации по бруцеллезу в 2016 г. и прогнозе заболеваемости на 2017 г. – М.:Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2016. – 7 с.

20. Письмо Роспотребнадзора от 22.02.2017 № 01/2375-17-32. Об эпизоотолого-эпидемиологической ситуации по туляремии в 2016 г. и прогнозе заболеваемости на 2017 г. – М.:Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2016. – 8 с.

21. Поздеев О. К. Медицинская микробиология: уч. для вузов / О. К. Поздеев. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2012. – 778 с.

22. Покровский В. И. Инфекционные болезни и эпидемиология. – Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2017. – 501 с.

23. Покровский В. И. Клиника, патогенез и лечение туляремии / В. И. Покровский, В. В. Малеев, А. К.Адамов. – Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2014.– 272 с.

24. Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей: МУ. – М.: ФГСМР, 2012. – 58 с.

25. СП 1.3.3118-13 Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил «Безопасность работы с микроорганизмами І-ІІ групп патогенности (опасности)"от 28 ноября 2013 г. N 64. – 136 с.

26. Тимаков В. Д. Микробиология / В. Д. Тимаков, В. С. Левашев, Л. Б. Борисов. – М.: Медицина. – 2013. – 260 с.

27. Туляремия. Эпидемиология и профилактика / М. Э. Чумаков, М. Ш. Шафеев, Л. М. Зорина и др. – Казань: КГМУ, 2012. – 47 с.

28. Хазенсон Л. Б. Иммунологические основы диагностики и эпидемологического анализа зоонозных инфекций / Л. Б. Хазенсон, Н. А.Чайка. – М.: Медицина, 2017. – 345 с.

29. Черкасский Б. Л. Справочник по особо опасным инфекциям / Б. Л. Черкасский. – М.: Медицина, 2016. – 160 с.

30. Госманов Р. Г. Микробиология / Р. Г. Госманов, А. К. Галиуллин, А. Х. Волков. – М.: Издательство «Лань», 2012.– 182 с.

31. Медицинское фото, статьи по медицине, книги по медицине, медицинское видео http://meduniver.com/Medical/Book/

 

 

Приложение 1

 

а) б)

 

 

Рис. 1 Вид чистой культуры Вrucellamelitensis: а) при микроскопии, б) при росте на сывороточном агаре

Приложение 2

Таблица 1

Основные физиолого-биохимические признаки бактерий р. Brucella

Виды и биовары	Потреб-ность в СО2	Образование Н2S	Рост на средах с красителями	Агглютинация моноспецифическими сыворотками	Лизис тбилисским фагом
Основ-ной фуксин а	Тионин	Brucella abortus	Brucella melitensis	РД	РД
а	b
B. melitensis биовар		– – –	– – –	+ + +	– – –	+ + +	– + +	+ – +	– – –	– – –
B.abortus биовар		+ – + – + – + – – – – + –	+ + + + – – – + – +	+ – + + + + + + +	– – + – – – – – –	– – + – + + + + +	+ + + – – + + – –	– – – + + – + + +	+ + + + + + + + +	+ + + + + + + + +
В. suis биовар		– – – – –	+ – – – –	– – + + –	+ – + + +	+ + + + –	+ + + + +	– – – + +	– – – – –	+ + + + +
B.ovis		+	–	+	+	+	–	–	–	–
B. neotomae		–	+	–	–	+	+	–	–	+
B. canis		–	–	–	+	+	–	–	–	–

Примечание: а – концентрация в мкг/мл среды 1:25000;b – концентрация в мкг/мл среды 1:50000; РД – рабочая доза фага (стандартное тест-разведение).

Приложение 3

a) б)

Рис. 2 Вид чистой культуры Francisellatularensis: а) при микроскопии, б) при росте на шоколадном агаре

 

 

 

 

Приложение 4

 

 

Рис. 3 Клинические проявления бруцеллеза: а) бруцеллез сухожильных влагалищ; б) артрит коленного сустава при бруцеллезе

 

Приложение 5

 

 

Рис. 4 Язвенно-бубонная форма туляремии

 

Приложение 6

Общая схема микробиологической диагностики

бруцеллеза

Высев на сывороточный, печеночный или кровяной агар Микроскопия мазков, окрашенных по Граму Аллерген бруцеллеза Биологический метод (внутрикожный способ введения) Сыворотка крови   Реакция Райта с бруцеллезным диагностикумом (1:10) Высев в сывороточный бульонили МПБ с 1% глюкозой и 1% глицерином Инкубация в термостате при 370С, 4-5 дней Учет роста на сывороточном бульоне или МПБ с 1% глюкозой и 1% глицерином Диагностикум по 0,03 мл в каждую лунку кроме контроля Дифференциация бруцелл

 

Признак	СО2	Н2S	Рост на средах с красителями	Агглютинация с моно- сывороткой
Вид бруцелл			Фуксин	Тионин	А	М
B.melitensis	–	–	+	+	–	–
B. abortus	+	+	+	–	+	–
B. suis	–	+	–	+	+	–

Учет роста на печеночном, сывороточноми кровяном агаре

Инкубация в термостате при 370С, 4-5 дней

Микроскопия мазков, окрашенных по Граму

Пересев на скошеный агар

Общая схема микробиологической диагностики туляремии

Микроскопия мазка-отпечатка

Выявление возбудителя в прямой РИФ

Микроскопия мазков, окрашеных по Граму (проверка чистоты)

Учет роста на скошенном агаре

Засев «пестрого ряда» для изучения биохимических свойств

Микроскопия мазков, окрашенных по Граму

Пересев на скошен-ный агар

Изучение антигенных свойств (реакция агглютинации со специфической туляремийной сывороткой)

Инкубация в термостате при температуре 370С

Инкубация в термостате при температуре 370С

Учет роста на средах (свернутом желточном, глюкозо-цистиновом агаре с кровью)

Заражение лабораторных животных

Высев материала от лабораторных животных на питательные среды

Материал для исследования

Заражение куриных эмбрионов

 

 

 

 

 

 

Приложение 8

Образцы бланков выдачи результатов исследований биологического материала на наличие в нем возбудителей бруцеллеза и туляремии

 

 

 

[1]Красноженов Е. П. Микробиологическая диагностика инфекционных заболеваний. М.:Феникс. 2006. 280 с.

[2]Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: в 2-х тт., Т. 2: учеб. по дисциплине «Микробиология, вирусология и иммунология» для студентов учреждений высш. проф. образования / под ред. В. В. Зверева, М. Н. Бойченко. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. 480 с.