Реакция нейтрализации антигена

Реакция нейтрализации антигена может служить дополнительным методом серологической диагностики туляремии и применяется при необходимости подтверждения достоверности результатов реакции пассивной гемагглютинации. Достоинством РНАг является способность выявлять не только полные антитела, но и не полные, так называемые блокирующие антитела. Последние отличаются тем, что вступают в связь со специфическим антигеном (блокируют, нейтрализуют его), но не способны вызывать явление гемагглютинации.

В связи с тем, что в РНАг выявляются как полные, так и неполные антитела, т.е. все антитела, связывающие антиген, часто титр антител в этой реакции бывает выше, чем в РПГА. Особенно эффективна РНАг при ранней диагностике заболевания. РНАг является высокоспецифичной трехкомпонентной реакцией. Механизм реакции состоит в специфической нейтрализации вводимого в реакцию туляремийного антигена антителами, содержащимися в исследуемом материале.

РНАг выполняют с использованием туляремийного эритроцитарного иммуноглобулинового (антительного) диагностикума. Препарат представляет собой формализированные, танизированные эритроциты, сенсибилизированные гамма-глобулином туляремийной агглютинирующей сыворотки, готовится в жидком и сухом виде. Жидкий препарат – 2,5% взвесь эритроцитов с добавлением мертиолата натрия до 1: 10 000. Сухой препарат – высушенная в вакууме 10% взвесь эритроцитов без консерванта. Перед употреблением его разводят в соответствии с указанием на этикетке. При постановке реакций в полистироловых пластинах оба препарата применяют в 2,5% концентрации, а на микротитраторе Такачи – в 0,5% концентрации.

Техника постановки РНАг. В ряд лунок полистироловой пластины наливают по 0,25 мл разводящей жидкости (1%-ный раствор нормальной кроличьей сыворотки на физиологическом растворе рН 7,0-7,2, предварительно инактивированной при 56 С в течение 30 минут). Затем в первую и последнюю лунки вносят по 0,25 мл исследуемой сыворотки, разведенной 1:5, титруют переносом по 0,25 мл до последней лунки. Из предпоследней и последней лунок лишние 0,25мл выливают. Получают следующий ряд разведений сыворотки – 1:10, 1:20, 1:40 и так далее. После этого во все лунки добавляют по 0,25 мл туляремийной культуры такой концентрации, чтобы в этом объеме содержались 2 гемагглютинирующие единицы антигена. Для определения необходимого количества антигена в 8-10- лунок наливают по 0,5 мл разводящей жидкости. В первую лунку добавляют 0,5 мл культуры туляремийных бактерий в концентрации 5 млн. микробных клеток в 1 мл и титруют переносом из одной лунки в другую по 0,5 мл. Затем в каждое разведение добавляют 1 каплю (0,05 мл) туляремийного эритроцитарного иммуноглобулинового диагностикума 2,5% концентрации. Результаты учитывают через 2-3 часа. Концентрация антигена в последней лунке с положительной гемагглютинацией соответствует 1 гемагглютинирующей единице (ГЕ). Для РНАг туляремийные бактерии берут в 4-х кратной концентрации, принимая во внимание, что в лунки добавляют 0,25 мл, т.е. именно в этом объеме должны содержатся 2 ГЕ.

Смесь испытуемой сыворотки и взвеси туляремийных бактерий оставляют на 1 час при комнатной температуре. Затем во все лунки, кроме последней, добавляют по одной капле иммуноглобулинового диагностикума, а в последнюю лунку – одну каплю контрольных эритроцитов, 2,5% концентрации. Пластину встряхивают и оставляют на ровной поверхности. Учет производят через 2-3 часа.

Учет и оценка РНАг. Если в исследуемой сыворотке есть противотуляремийные антитела, то в первых лунках, где их количество большее, они полностью нейтрализуют внесенный в дозе 2 ГЕ антиген. Эритроциты не агглютинируются и оседают на дно лунок в виде пуговок с ровными краями. Результат реакции в таких лунках отмечается как положительный, а в протоколах отмечается знаком (-). Максимальное разведение сыворотки, то есть. последняя лунка, в которой отсутствует агглютинация эритроцитов, оценивается как титр реакции. При отсутствии в исследуемой сыворотке туляремийных антител наблюдается агглютинация эритроцитов во всех лунках. Результат отмечается как отрицательный, а в протоколах отмечают знаком (+). Результаты реакции учитывают, если в контрольной (последней) лунке эритроциты выпали на дно в виде пуговки (агглютинация отсутствует).

При постановке РНАг количество вводимого в реакцию туляремийного антигена должно соответствовать расчетному (2ГЕ в объеме 0,25 мл). Завышение дозы антигена приведет к избытку его во всех лунках и титр реакции будет занижен, а при исследовании сывороток с невысоким титром антител может быть получен отрицательный результат. Отсюда следует необходимость контроля расчетного количества гемагглютинирующих единиц. Контроль ставят следующим образом. Первую лунку отведенного для контроля ряда оставляют пустой, а в последующие 4-5 лунок наливают по 0,25 мл разводящей жидкости. Затем в первую и вторую лунки наливают по 0,25 мл контролируемого антигена и титруют, начиная со второй лунки. После этого во все лунки наливают по 0,25 мл разводящей жидкости и по одной капле (0,05 мл) иммуноглобулинового диагностикума. Пластину встряхивают и оставляют до полного оседания эритроцитов (2-3 часа). Если полноценная гемагглютинация произойдет только в первых двух лунках, значит концентрация антигена рассчитана правильно. Контроль антигена повторяют одновременно с каждой постановкой реакции. Величину гемагглютинирующей единицы антигена определяют заново для каждой серии иммуноглобулинового диагностикума и микробной взвеси. Если обнаружится, что концентрация рабочего раствора антигена отличается от расчетной, необходимо повторить реакцию. [15]