Иммерсионный микроскоп. Принцип работы. Сфера применения.

Иммерсионный микроскоп. Принцип работы. Сфера применения.

Иммерсионный объектив (от лат. immersio — погружение) - между фронтальной линзой объектива и объектом находится иммерсионная среда:

◦ вода (n=1,33) - водная иммерсия;

◦ глицерин (n=1,43) - глицериновая иммерсия;

◦ иммерсионное масло (n=1,51) - масляная иммерсия.

Для исключения преломления света => уменьшается величина преломляющей способности

Сфера применения: изучение окрашенных микропрепаратов.(бактериологический метод диагностики)

Достоинства

◦ Высокое разрешение

◦ Простота настройки и использования

Недостатки

Необходимость фиксации и окраски препаратов

Принцип действия:

Полезное увеличение x90. Имм. масло ↑апертуру объектива и разрешающую способность. Имеет коэффициент преломления как у предметного стекла 1.5, при этом Z = 0.2 мкм = 200 нм

 

Принципы классификации микроорганизмов. Понятие о виде и штамме.

Микроорганизмы (бактерии, грибы, простейшие, вирусы), систематизированы по их сходству, различиям и взаимоотношениям между собой. Этим занимается специальная наука — систематика микроорганизмов. Систематика включает три части: классификацию, таксономию и идентификацию. В основу таксономии микроорганизмов положены их морфологические, физиологические, биохимические и молекулярно-биологические свойства. Различают следующие таксономические категории: царство, подцарство, отдел, класс, порядок, семейство, род, вид, подвид и др. В рамках той или иной таксономической категории выделяют таксоны — группы организмов, объединенные по определенным однородным свойствам.

Микроорганизмы представлены доклеточными формами (вирусы — царство Vira) и клеточными формами (бактерии, архебактерии, грибы и простейшие). Различают 3 домена (или «империи»): «Bacteria», «Archaea» и «Eukarya»:

□ домен «Bacteria» — прокариоты, представленные настоящими бактериями (эубактериями);

□ домен «Archaea» — прокариоты, представленные архебактериями;

□ домен «Eukarya» — эукариоты, клетки которых имеют ядро с ядерной оболочкой и ядрышком, а цитоплазма состоит из высокоорганизованных органелл — митохондрий, аппарата Гольджи и др. Домен «Eukarya» включает: царство грибы; царство животных (включает простейшие); царство растения. Домены включают царства, типы, классы, порядки, семейства, роды, виды. + Вирусы

Морфологическая классификация: кокки, палочки, извитые, нитчатые, полиморфные

Примеры: менингококк, сальмонеллы, клостридии, холерный вибрион.

Вид. Одной из основных таксономических категорий является вид (species). Вид — это совокупность особей, объединенных по близким свойствам, но отличающихся от других представителей рода.

Чистая культура. Совокупность однородных микроорганизмов, выделенных на питательной среде, характеризующихся сходными морфологическими, тинкториальными (отношение к красителям), культуральными, биохимическими и антигенными свойствами. (культура микроорганизмов одного вида)

Штамм. – чистая культура микроорганизмов, выделенная из того или иного источника(из организма или внешней среды);(чистая культура микроорганизмов, выделенная либо из разных источников, либо из одного источника в разное время)

Клон - совокупность потомков, выращенных из единственной микробной клетки.

(потомство одной клетки)

 

Основные группы микроорганизмов. Значение в патологии человека. Примеры.

1.Прокариота- организмы, не обладающие оформленным ядром и внутриклеточными мембранными структурами

1.1 Собственно бактерии – наиболее обширная группа паразитических и свободно живущих прокариота, обладающих жесткой клеточной стенкой (брюшной тиф; сибирская язва; газовая гангрена)

1.2 Актиномицеты – бактерии способные к образованию длинных септированных или несептированных нитей (нитчатые бактерии) (актиномикоз)

Значение в паталогии человека - многие актиномицеты используются в качестве штаммов-продуцентов при производстве антибиотиков и ферментных препаратов)

1.3 Микоплазмы – бактерии, не имеющие клеточной стенки (атипичная пневмония; урогенитальный микоплазмоз)

1.4 Риккетсии – бактерии, облигатные внутриклеточные паразиты (эпидемический сыпной тиф; клещевой риккетсиоз; пятнистая лихорадка скалистых гор; лихорадка цуцугамуши)

1.5 Хламидии – бактерии, облигатные внутриклеточные паразиты. Отличаются от риккетсий сложным циклом внутриклеточного размножения (трахома; хламидийная пневмония)

1.6 Спирохеты – спирально извитые микроорганизмы. Отличаются наличием внутриклеточных фибриллярных структур (сифилис;лептоспироз; боррелиоз Лайма)

2. Эукариота – организмы, обладающие оформленным ядром и внутриклеточными мембранными структурами

2.1 Простейшие – одноклеточные эукариотические животные

2.2 Низшие грибы – гетеротрофные одноклеточные и многоклеточные микроорганизмы

3. Вирусы – неклеточная форма жизни

 

Питательные среды. Требования, предъявляемые к питательным средам.

Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.

Питательные среды готовят из продуктов животного или растительного происхождения. Большое значение имеет наличие в питательной среде ростовых факторов, которые катализируют метаболические процессы микробной клетки (витамины группы В, никотиновая кислота и др.).

Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ.

В бактериологической практике чаще всего используют сухие питательные среды, которые получают на основе достижений современной биотехнологии. Для их приготовления используют экономически рентабельное непищевое сырье.Сухие питательные среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке и имеют относительно стандартный состав.

Требования:

1) Питательная ценность и сбалансированность

2) Стерильность

3) Оптимальное значение активности воды (0,95..)

4) Оптимальный PH (7,2-7,4)

5) Оптимальные ок-вост потенциалы

6) Оптимальное значение вязкости

-Агар Эндо (Состав: Питательная основа - питательный агар (мясо-пептонный агар)

Дифференцирующий фактор - лактоза

Индикатор - фуксин-сернистый реактив (фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия)

Принцип действия: при расщеплении лактозы в питательной среде накапливаются кислые метаболиты. В кислой среде фуксин высвобождается и окрашивает лактозоположительные колонии в красный цвет. При интенсивном кислотообразовании колонии приобретают металлический блеск

Лактозонегативные колонии бесцветные или окрашенные в цвет среды (бледно розовые)

Назначение: выделение и дифференцировка по лактозному признаку энтеробактерий)

-Кровяной Агар (Состав: питательная основа - питательный агар (мясо-пептонный агар)

Дифференцирующий фактор - кровь (эритроциты); Индикатор - нет

Принцип действия: кровь является фактором роста, необходимым для многих требовательных микроорганизмов

Некоторые микроорганизмы обладают гемолитической активностью и способны образовывать колонии, окруженные зоной гемолиза.

Таким образом среда позволяет дифференцировать микроорганизмы по наличию и типу гемолиза

Назначение: выделение и дифференцировка микроорганизмов по гемолитической активности. Выделение и культивирование требовательных микроорганизмов.

- Солевой Агар (Состав: питательная основа - питательный агар (мясо-пептонный агар)

Элективный фактор - 10% хлорида натрия

Принцип действия: высокая концентрация хлорида натрия подавляет рост большинства микроорганизмов. Стафилококки при концентрации соли 10% не подавляются и формируют на среде изолированные колонии.

Назначение

Выделение стафилококков с одновременным подавлением сопутствующей микрофлоры.

- Желточно-солевой (Состав: питательная основа - питательный агар (мясо-пептонный агар) Дифференцирующий фактор - лецитин (эмульсия куринного желтка)

Элективный фактор - 10% хлорида натрия Индикатор - отсутствует

Принцип действия

Высокая концентрация хлорида натрия подавляет рост большинства микроорганизмов. Стафилококки при концентрации соли 10% не подавляются.

Наличие в среде лецитина позволяет дифференцировать стафилококки по наличию лецитовителазы. При расщеплении лецитина образуются нерастворимые продукты, выпадающие в толще среды вокруг колоний, образуя "перламутровую" зону.

 

Назначение

Выделение стафилококков и дифференцировка по лецитовителазному признаку (S.aureus - lec+, остальные - lec-) с одновременным подавлением сопутствующей микрофлоры.

-Агар Плоскирева (Состав: питательная основа - питательный агар (мясо-пептонный агар)

Дифференцирующий фактор – лактоза- элективный фактор - соли желчных кислот

Индикатор - нейтральный красный Принцип действия:

Соли желчных кислот подавляют рост сопутствующей микрофлоры. Поскольку полного подавления не происходит, колонии вырастающих микроорганизмов можно дифференцировать по способности расщеплять лактозу. В питательной среде накапливаются кислые метаболиты. В кислой среде нейтральный красный окрашивает лактозоположительные колонии в красный (брусничный) цвет.

Назначение

Выделение лактозонегативных патогенных энтеробактерий (сальмонеллы и шигеллы)

-Солевой бульон (Состав: питательная основа - питательный бульон (мясо-пептонный бульон)Элективный фактор - 10% хлорида натрия

Принцип действия

Высокая концентрация хлорида натрия подавляет рост большинства микроорганизмов. Стафилококки при концентрации соли 10% размножаются. Если в исходном материале стафилококков было мало, то после инкубации их концентрация увеличится и при высеве из накопительной среды на плотную мы получим рост колоний стафилококков.

Назначение

Накопление стафилококков с одновременным подавлением сопутствующей микрофлоры.

-Сахарно-кровяной Агар (Состав: питательная основа - питательный агар (мясо-пептонный агар) Дыхательный субстрат – глюкоза Редуцирующий фактор - кровь (гемоглобин эритроцитов)

Принцип действия

Глюкоза является дыхательным субстратом, используемым анаэробами в энергетических процессах

Гемоглобин, содержащийся в эритроцитах, связывает токсичные формы кислорода, понижая окислительно-восстановительный потенциал среды

Для обеспечения роста строгих анаэробов чашки необходимо инкубировать в бескислородной атмосфере.

Назначение

Выделение чистой культуры облигатно анаэробных бактерий.

-Тиогликолевая (среда контроля стерильности) Состав

Питательная основа - питательный бульон (мясо-пептонный бульон) + 0,1% агар-агара

Дыхательный субстрат – глюкоза Редуцирующий фактор - тиоловые соединения (тиогликолят натрия и цистеин)

Принцип действия

Глюкоза является дыхательным субстратом и используется в энергетических анаэробных процессах.

Тиоловые соединения связывают токсичные формы кислорода и снижают окислительно-восстановительный потенциал среды.

Небольшое количество агар-агара повышает вязкость среды и уменьшает насыщение среды кислородом в результате конвекции.

Назначение

Накопление анаэробных микроорганизмов.

-среда Вильсона-Блер Состав питательная основа - питательный агар (мясо-пептонный агар) Дыхательный субстрат – глюкоза Редуцирующий фактор - сульфит натрия

Индикатор - хлористое железо (индикатор на серводород)

Принцип действия

Глюкоза является дыхательным субстратом и используется в энергетических анаэробных процессах.

C.perfringens восстанавливает сульфит натрия до сульфида, который, взаимодействуя с ионами железа образует черное нераствориемое соединение - сульфид железа.

Назначение

Обнаружение сульфитредуцирующих клостридий (в первую очередь Clostridium perfringens)

 

Классификация питательных сред. Особенности состава и области применения. Примеры.

Классификация питательных сред

По составу

◦ Простые - содержат основные компоненты белкового питания. Используются в качестве питательной основы для приготовления сложных питательных сред

Например: пептонная вода, мясо-пептонный бульон, питательный агар

Сложные - содержат питательную основу и различные добавки: ростовые, дифференцирующие, селективные, хромогенные

Например: кровяной агар, солевой агар, селенитовый бульон

По консистенции

◦ Жидкие (бульоны) - не содержат гелеобразующих веществ

Например: солевой бульон, пептонная вода

◦ Полужидкие - содержат 0,1 - 0,7% агар-агара

Например: тиогликолевая среда (среда для контроля стерильности)

◦ Плотные (агары) - содержат 1,0 - 2,0% агар-агара

Например: мясо-пептонный агар, среда Эндо...

По назначению

Дифференциальные - выделение чистой культуры микроорганизмов и одновременной дифференцировке по биохимическим (как правило) свойствам (диф фактор, индикатор, пит основа(МПА, лактоза, осн фуксин)

Например: среда Эндо, кровяной агар

Элективные - предназначены для подавления роста сопутствующей микрофлоры с целью облегчения выделения целевого микроорганизма в чистой культуре.

Например: солевой агар

Элективно-дифференциальные - предназначены для выделения чистой культуры микроорганизмов и одновременного подавления роста сопутствующей микрофлоры. Вырастающая сопутствующая микрофлора дифференцируется от целевых микроорганизмов по биохимическим свойствам. (МПА, элективный фактор, диф фактор и индикатор)

Например: желточно-солевой агар, агар Плоскирева

Обогатительные - увеличение концентрации микроорганизмов в исследуемом материале, с последующем выделением чистой культуры путем высева на плотную среду. В зависимости от характеристики исследуемой пробы обогатительные среды могут обладать селективностью или быть неселективными (МПБ, обогат фактор)

Например: сахарный бульон, солевой бульон

Синтетические - состоят из химически чистых компонентов, что позволяет создавать строго контролируемые условия роста. Предназначены для изучения метаболизма (аксотрофы и прототрофы), генетических экспериментов и т.п (вода, глюкоза и мин соли/орг молек)

Например: агар М9

Среды для анаэробов - выделение и культивирование строгих анаэробов (глюкоза + ред фактор)

Например: анаэробный кровяной агар, тиогликолевая среда, среда Вильсона-Блер

 

Достоинства

· Высокая эффективность

· Широкий перечень стерилизуемых объектов

· Минимальное повреждение стерилизуемых объектов

· Возможность стерилизации упакованных изделий

Недостатки

◦ Аппаратура работает под повышенным давлением

◦ Возможна коррозия металлических объектов

Воздушная стерилизация

В воздушных стерилизаторах осуществляют стерилизацию сухим нагретым воздухом. Поскольку стерилизующий эффект сухого воздуха значительно слабее, чем у насыщенного пара. испольхуются волее высокие температуры (160 - 180 ⁰С) и длительные экспозиции (60 - 120 мин). Для равномерного прогрева воздушные стерилизаторы имеют встроенный вентилятор.

Использование:

Стерилизация стеклянной посуды, термостабильных порошков, металлических инструментов.

Достоинства

◦ Простота управления

◦ Низкие эксплуатационные расходы

◦ Возможность упаковки стерилизуемых объектов

Недостатки

◦ Ограниченный перечень стерилизуемых объектов

◦ Большая продолжительность цикла стерилизации

Прокаливание в пламени

Газовые горелки и спиртовки используют для стерилизации открытым пламенем. В случаях, когда невозможно применить открытое пламя, возможно использование инфракрасных нагревателей.

Использование:

Стерилизация мелких металлических инструментов: бактериологические петли, препаравальные иглы, пинцет...

Достоинства

◦ Практически мгновенная стерилизация

Недостатки

◦ Нельзя хранить простерилизованный инстумент

◦ Только для мелких инструментов

◦ Пожароопастность

Газовая стерилизация

Низкотемпературный метод стерилизации, с использованием окиси этилена. Данный газ обладает хорошими микробоцидными свойствами и проникающей способностью.

Достоинства

◦ Возможность стерилизации объектов, не выдерживающих высокие температуры

◦ Надежная упаковка стерилизуемых изделий

◦ Высокая надежность стерилизации

Недостатки

◦ Очень высокая токсичность газа

◦ Необходимость длительного проветривания простерилизованных объектов

Плазменная стерилизация

Стерилизация проводится парами 60% раствора Н₂О₂ и низкотемпературной плазмы. Это делает данный метод универсальным, поскольку позволяет обрабатывать любые изделия, в том числе и волоконную оптику. Перед стерилизацией изделия должны быть упакованы в специальную упаковку.

Достоинства

◦ Универсальность

◦ Низкая температура стерилизации

◦ Высокая эффективность стерилизации

◦ Экологически безопасный метод (конечные продукты - Н₂О и О₂)

Недостатки

◦ Высокая стоимость оборудования

Необходимость специальной упаковки (обычные упаковочные материлы не годятся)

Иммерсионный микроскоп. Принцип работы. Сфера применения.

Иммерсионный объектив (от лат. immersio — погружение) - между фронтальной линзой объектива и объектом находится иммерсионная среда:

◦ вода (n=1,33) - водная иммерсия;

◦ глицерин (n=1,43) - глицериновая иммерсия;

◦ иммерсионное масло (n=1,51) - масляная иммерсия.

Для исключения преломления света => уменьшается величина преломляющей способности

Сфера применения: изучение окрашенных микропрепаратов.(бактериологический метод диагностики)

Достоинства

◦ Высокое разрешение

◦ Простота настройки и использования

Недостатки

Необходимость фиксации и окраски препаратов

Принцип действия:

Полезное увеличение x90. Имм. масло ↑апертуру объектива и разрешающую способность. Имеет коэффициент преломления как у предметного стекла 1.5, при этом Z = 0.2 мкм = 200 нм