И. С. В и т о л, Г. М. Суслянок

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ

 

 

И. С. В и т о л, Г. М. Суслянок

 

Биохимические основы пищевых технологий

 

Курс лекций

 

 

Москва 2012

Введение

Биохимические процессы, протекающие при хранении сырья и при производстве пищевых продуктов, связаны с действием собственных (эндогенных) ферментов пищевого сырья, а также ферментов, вносимых на различных стадиях технологического процесса в виде ферментных препаратов.

Ферменты ( от лат. fermentum — закваска ) или энзимы ( от греч. en zýme — в дрожжах ) — биологические катализаторы белковой природы, присутствующие в любой живой клетке, а, следовательно, и в любом пищевом сырье растительного и животного происхождения. Они обеспечивают взаимосвязь многих сложных биохимических превращений в клетках растений животных, микроорганизмов. Знания особенностей протекания биохимических процессов в пищевом сырье позволяют выявить скрытые резервы, выбрать оптимальные режимы переработки сырья, тем самым повысить ее эффективность, а в конечном счете, разрабатывать новые ресурсо- и энергосберегающие технологии.

Ферментные препараты — это, прежде всего, ферменты, продуцируемые различными микроорганизмами; кроме того, для их получения используют проросшее зерно, ткани животных и тропические растения. Ферментные препараты отличаются от ферментов тем, что помимо основного активного белка содержат балластные вещества, в том числе и белки. Существуют ферментные препараты, в состав которых входит только один фермент, они имеют высокую степень очистки. Однако подавляющее большинство ферментных препаратов являются комплексными, то есть помимо основного фермента, обладающего наибольшей активностью, содержат сопутствующие ферменты, действие которых также необходимо учитывать при их использовании в технологических процессах переработки пищевого сырья.

 

 

Глава 1. Общие свойства ферментов и факторы,

Влияющие на скорость биохимических

Процессов

 

Ферменты значительно повышают скорость химических реакций, которые в их отсутствие протекают очень медленно; при этом ферменты не расходуются и не претерпевают необратимых изменений.

Механизм ферментативной реакции может быть выражен следующим уравнением:

E + S ES → P + E, где

 

E – фермент, S – субстрат; ES – фермент-субстратный комплекс; P – продукты реакции

 

Ферментативная реакция состоит из двух стадий: на первой стадии происходит образование фермент-субстратного комплекса, переходному состоянию которого требуется более низкая энергия активации; на второй стадии этот комплекс распадается на продукты реакции и свободный фермент, который может взаимодействовать с новой молекулой субстрата. Таким образом, ферменты ускоряют химические реакции за счет того, что позволяют молекулам преодолевать активационный барьер на более низком энергетическом уровне.

Для проявления каталитической активности совершенно необходимо, чтобы все функциональные группы фермента располагались в пространстве строго определенным образом относительно друг друга, формируя активный центр фермента, который и обеспечивает взаимодействие с субстратом.

По химическому строению ферменты можно разделить на однокомпонентные (состоящие только из белка) и двухкомпонентные ферменты (состоящие из белковой части — апофермента и небелковой части — кофермента, участвующего в действии фермента в качестве обязательного кофактора). В результате ферментативных реакций коферменты, как правило, не подвергаются изменениям, однако при ряде последовательно протекающих реакций, кофермент может представлять собой субстрат для отдельных ферментов, хотя и регенерируется, в конечном счете, в исходной форме. Химическая природа коферментов, их функции в ферментативных реакциях и механизм действия чрезвычайно разнообразны. Так, например, в качестве коферментов могут выступать витамины и их производные.

В соответствии с химическим строением коферменты можно подразделить на следующие группы:

§ коферменты алифатического ряда (глютатион, липоевая кислота),

§ коферменты ароматического ряда (коэнзим Q — убихинон),

§ коферменты — гетероциклические соединения (производные витамина В₆, В₁, биотин (витамин Н), производные фолиевой кислоты),

§ коферменты — нуклеотиды и нуклеозиды (коэнзим А, НАД⁺, НАДФ⁺, ФАД, ФМН).

 

Ферменты как органические катализаторы белковой природы обладают рядом особенностей, которые отличают их от неорганических катализаторов.

Во-первых, это огромная сила каталитического действия. Ферменты в 10⁸–10¹² раз повышают скорость катализируемых реакций.

Во-вторых, это специфичность действия ферментов. Они катализируют строго определенные реакции. Только благодаря специфичности ферментативного катализа возможна строгая упорядоченность и взаимосвязь отдельных ферментативных реакций, лежащих в основе биологического обмена веществ в живой клетке.

По степени специфичности отдельные ферменты достаточно сильно различаются между собой. Различают следующие основные типы специфичности:

– абсолютная специфичность — фермент катализирует превращение только одного субстрата;

– групповая специфичность — фермент действует на группу родственных субстратов, обладающих определенным структурным сходством;

– специфичность по отношению к определенным типам реакций — такие ферменты проявляют наименьшую специфичность, они действуют независимо от того, какие группы присутствуют вблизи той связи, на которую направлено действие фермента;

– стереохимическая специфичность — фермент катализирует превращение только одной стереохимической формы субстрата.

 

Третьей особенностью ферментов является их лабильность. Это означает, что ферменты подвержены влиянию различных факторов и могут изменять свою активность под влиянием рН среды, температуры, при действии активаторов и ингибиторов и др. Лабильность или изменчивость ферментов обусловлена их белковой природой, сложной пространственной конформацией белковой молекулы.

Таким образом, ферментативный катализ существенно отличается от неферментативного. Скорость протекания биохимических процессов будет зависеть от ряда факторов: от химической природы реагирующих веществ, концентрации субстрата и фермента, температуры и рН среды, наличия различных эффекторов (активаторов и ингибиторов).

Вопросы, связанные с кинетикой ферментативных реакций, детально изложены в специальных разделах биохимии и энзимологии. Поэтому особое внимание будет уделено тем положениям, которые необходимы для грамотного подхода к работе с ферментами. Наличие фермента в растворе или экстракте можно определить исходя из скорости катализируемой им реакции, о которой судят либо по накоплению продуктов реакции, либо по убыли субстрата.

Для того чтобы правильно определить потенциальные возможности данного фермента как катализатора, нужно учитывать скорость ферментативной реакции в тот момент времени, когда наблюдается прямая пропорциональная зависимость между продуктами реакции и временем, то есть реакция идет по нулевому порядку. Такая скорость называется начальной скоростью ферментативной реакции и обозначается V₀. На практике V₀ определяют графическим методом: экспериментально строят кривую хода ферментативной реакции во времени. Начальная скорость определяется как тангенс угла наклона касательной, проведенной из начала координат к кривой хода ферментативной реакции.

Важнейшим фактором, определяющим скорость ферментативной реакции, является концентрация субстрата. Максимальная скорость реакции достигается при такой концентрации субстрата, когда все активные центры фермента насыщены субстратом и дальнейшее увеличение концентрации субстрата не приводит к увеличению скорости реакции.

При насыщающей концентрации субстрата, обеспечивающей V_max, начальная скорость ферментативной реакции будет, в первую очередь, зависеть от концентрации фермента. Эта зависимость прямо пропорциональная, что свидетельствует о том, что начальная скорость является мерой количества фермента.

Влияние температуры на активность фермента, которое может быть легко изучено экспериментально, имеет очень сложный характер, так как обусловлено целым рядом факторов, а именно:

§ влиянием температуры на скорость расщепления комплекса ES на свободный фермент и продукт реакции;

§ влияние температуры на сродство фермента к субстрату;

§ влияние на теплоту ионизации, а, следовательно, на процессы ионизации всех компонентов реакции: самого фермента, субстрата, промежуточных и конечных продуктов реакции;

§ влияние на образование таких соединений как «фермент – активатор» или «фермент – ингибитор»,

§ влияние на процесс денатурации ферментного белка.

Оптимальная температура, при которой наблюдается максимальная активность, для большинства ферментов находится в пределах 37⁰-50⁰С, но некоторые ферменты имеют температурный оптимум за пределами этой зоны. Резкое снижение скорости ферментативной реакции при температурах, превышающих оптимальную, связано, в первую очередь, с денатурацией ферментного белка. Поэтому очень важным показателем, характеризующим отношение фермента к температуре, является его термостабильность.

Термостабильность фермента складывается их двух критериев: величины температуры и времени ее воздействия на фермент. Кроме того, на термостабильность различных ферментов могут оказывать влияние и такие факторы, как рН среды, ее солевой состав, защитное действие субстрата.

Для каждого фермента характерна определенная узкая область значений рН, при которой он проявляет максимальную активность.

Зависимость активности фермента от рН отражает способность важных для данного фермента протон-донорных или протон-акцепторных групп в активном центре фермента переходить в состояние с требуемой степенью ионизации при определенных значениях рН. Ход кривых будет зависеть и от других факторов, в частности, изменение рН среды изменяет состояние ионизации субстрата (если это заряженное вещество), комплексов ES и EP, в некоторых, например, окислительно-восстановительных реакциях, ионы Н⁺ сами могут принимать участие в реакции; помимо этого скорость денатурации ферментативного белка зависит от рН.

При экспериментальном изучении активности фермента от рН следует помнить, что рН-оптимум зависит: от состава среды (от природы используемого буфера); оптимум рН прямой и обратной реакции могут быть совершенно различными; при действии одного и того же фермента на различные субстраты рН-оптимумы также могут быть различными. Кроме понятия оптимума рН, очень важным является понятие рН-стабильности. Это тот диапазон рН, при котором фермент или ферментый препарат сохраняет свою активность в течение определенного периода времени. рН-стабильность также зависит от ряда факторов, среди которых, кроме уже названных, форма ферментного препарата, степень его очистки и др.

Все выше сказанное позволяет утверждать, что, варьируя температурный режим и изменяя рН, можно в какой-то мере регулировать каталитическую активность фермента.

Влияние активаторов и ингибиторов. Активаторами называют вещества, которые повышают активность ферментов. Хорошим примером таких соединений являются аминокислота цистеин и восстановленный глютатион, содержащие свободную SH-группу. Они активируют тиоловые ферменты. Кроме того, некоторые ферменты активируются металлами, которые либо участвуют в построении активного центра, либо стабилизируют пространственную конформацию ферментного белка и, тем самым, обеспечивают проявление каталитических функций.

Ингибиторами называют вещества, специфически снижающие активность ферментов. Снижение или полная потеря активности ферментов могут быть вызваны разного рода денатурирующими воздействиями, в этом случае правильнее употреблять термин «инактивация» фермента.

Существует ингибирование двух основных типов: необратимое и обратимое. Обратимое ингибирование, в свою очередь, бывает конкурентным и неконкурентным.

Конкурентный ингибитор конкурирует с субстратом на основе структурного сходства, связываясь с активным центром фермента с образованием неактивного комплекса фермент-ингибитор. Отличительная особенность конкурентного ингибирования состоит в том, что его можно устранить или ослабить, повысив концентрацию субстрата.

Одними из самых распространенных неконкурентных ингибиторов являются аллостерические ингибиторы. Присоединяясь не к активному, а к другому, так называемому аллостерическому центру молекулы фермента, ингибитор вызывает конформационные изменения в структуре активного центра, вследствие чего, становится невозможным образование комплекса фермент – субстрат.

Изучение взаимодействия ферментов с ингибиторами и активаторами ферментов позволяет получать ценные сведения о субстратной специфичности ферментов, природе функциональных групп активного центра, механизмах каталитической активности. Так как в качестве ингибиторов могут выступать конечные продукты реакции, различные промежуточные продукты метаболизма, нет сомнения в той огромной роли, которую выполняют ингибиторы в регуляции ферментативной активности. Это подтверждает и факт широкого распространения ингибиторов белковой природы. Кроме того, по принципу специфического ингибирования действуют многие лекарственные препараты, антибиотики, токсичные вещества, антиалиментарные факторы питания.

Специфические ингибиторы, встречающиеся в пищевом сырье и пищевых продуктах, присутствуют в качестве составляющих, как в традиционных рецептурах, так и в сложных композиционных составах новых, модифицированных продуктов питания. Поэтому нельзя не учитывать их влияние на активность отдельных ферментов и на биохимические процессы в целом, протекающие при хранении и переработке пищевого сырья.

Все это лишний раз говорит о множестве сложных проблем, которые встречаются в экспериментальной работе с ферментами и использовании ферментных препаратов на практике.

Пищевых продуктов

 

Как уже отмечалось наибольшее практическое значение имеют представители двух классов ферментов, а именно: оксидоредуктазы и гидролазы. Остановимся на рассмотрении отдельных представителей этих двух важнейших для пищевой промышленности классов ферментов с позиции описания их свойств, активности, механизма реакции, и коснемся вопросов практического применения, которые будут рассмотрены более подробно в разделах, посвященных конкретным пищевым технологиям.

Гидролитические ферменты

Роль ферментов класса гидролаз в пищевых технологиях очень велика. Это находит отражение в специальной литературе, монографиях, технических инструкциях, стандартах. Поэтому в этом разделе остановимся на краткой характеристике наиболее важных представителей гидролитических ферментов. Для технологов наибольший интерес представляют три подкласса ферментов класса гидролаз. Это ферменты, действующие на сложноэфирные связи — эстеразы (Н.Ф. 3.1); действующие на гликозидные соединения — гликозидазы (Н.Ф. 3.2) и действующие на пептидные связи — протеазы (Н.Ф. 3.4).

Эстеразы (Н.Ф. 3.1). Этот подкласс включает большое число ферментов (около 150), которые разделены на семь подподклассов. Наиболее важными с точки зрения участия в различных биохимических процессах, имеющих место при хранении и переработке пищевого сырья, являются ферменты подподкласса 3.1.1 — ферменты, действующие на эфиры карбоновых кислот.

Липаза (Н.Ф. 3.1.1.3). Липаза, или триацилглицерол-липаза, широко распространена в природе и играет важную роль в процессах, протекающих при переработке и хранении пищевых продуктов. В настоящее время выделены и охарактеризованы липазы растительного (липаза клейщивины, пшеницы и других злаков); животного (панкреатическая липаза, липаза молока) и микробного (бактериальные и грибные липазы) происхождения. Обычно липазы катализируют реакцию расщепления триглицеридов на глицеринсмесь жирных кислот. Многочисленные экспериментальные данные дают основание предположить следующий путь липолиза:

 

Триглицерид 1,2-Диглицерид 2-Моноглицерид Глицерин

 

Установлено, что липазы быстрее отщепляют остатки высокомолекулярных жирных кислот, чем низшие карбоновые кислоты. Ферментативный гидролиз липидов имеет существенное отличие от других гидролитических реакций. Парадокс заключается в том, что липаза — водорастворимый фермент, а ее субстрат гидрофобен; однако, активность липазы возрастает на границе «вода – липид». Этот феномен известен под названием «межфазная активация».

Липазы различного происхождения сильно отличаются друг от друга по специфичности действия, сродству к различным субстратам, растворимости, оптимуму рН и другим свойствам. Так, например, липаза семян клещевины нерастворима в воде, имеет оптимум рН 4,7–5,0; панкреатическая липаза растворима и оптимум рН ее действия лежит в слабощелочной среде. Липазы микробного происхождения и липаза пшеничных зародышей также отличаются от липазы клещевины. Они растворимы в воде и имеют рН оптимум при 8,0. Липаза молока, молекулярная масса которой примерно 7000 Да, имеет оптимум рН 9,0–9,2 при гидролизе молочного жира.

Зерновая липаза участвует в процессе порчи зерновых продуктов при хранении. Особенно это касается продуктов, содержащих повышенное количество жира, например, овсяной муки или крупы, пшена. Накопление свободных жирных кислот под действием липазы (рост кислотного числа жира) — признак ухудшения качества продукта. Свободные жирные кислоты, особенно ненасыщенные, легко подвергаются окислению под воздействием разных факторов: липоксигеназы, тепловой обработки, кислорода воздуха, солнечного света и др. Таким образом, липазы могут инициировать процесс прогоркания и ограничивать сроки хранения пищевых продуктов.

Одна из особенностей липаз связана с тем, что эти ферменты способны катализировать и обратную реакцию, осуществлять синтез сложных эфиров, а также производить переэтерефикацию триглицеридов, т.е. изменять их жирнокислотный состав. На этом основании разрабатываются способы получения новых форм жировых продуктов с использованием специфических липаз.

Пектинэстераза (Н.Ф. 3.1.1.11). Пектинэстеразы синтезируются высшими растениями, микроскопическими грибами, дрожжами, и бактериями.Пектинэстераза катализирует гидролиз сложноэфирных связей в молекуле растворимого пектина, отщепляя метоксильные группы, в результате чего образуется метиловый спирт и полигалактуроновая кислота.

Желирующая способность пектина зависит от степени метоксилирования или степени этерификации, поэтому действие пектинэстеразы по отщеплению метоксильных групп приводит к снижению желирующей способности и сопровождается падением вязкости. На этом, очевидно, и основывается применение этого фермента для осветления плодовых соков и вина. Обычно комплексные препараты пектолитических ферментов, применяемые для этих целей, получают из различных плесневых грибов, и прежде всего из A. niger.

Гидролазы гликозидов, или гликозидазы, (Н.Ф. 3.2). Этот подкласс включает около ста ферментов с разной специфичностью действия, осуществляющих гидролиз олиго- и полисахаридов; некоторые ферменты этого типа способны осуществлять трансферазные реакции — переносить гликозидные остатки на олиго- и полисахариды, наращивать полисахаридные цепочки. Основной формой запасных углеводов в семенах и клубнях растений является крахмал. Ферментативные превращения крахмала лежат в основе многих пищевых технологий. Поэтому ферменты амилолитического комплекса растительного, животного и микробного происхождения интенсивно изучаются со времени их открытия К. С. Кирхгофом в 1814 году и до настоящего времени.

α-Амилаза (Н.Ф. 3.2.1.1). α-Амилазы обнаружены у животных (в слюне и поджелудочной железе), в растениях (проросшее зерно пшеницы, ржи, ячменя), они вырабатываются микромицетами и бактериями. Все эти ферменты гидролизуют крахмал, гликоген и родственные α-1,4-глюканы с образованием, главным образом, декстринов и небольшого количества дисахарида мальтозы.

Скорость, с которой α-амилазы гидролизуют глюканы различной степени полимеризации, быстро уменьшается по мере ее снижения. Амилоза — линейная фракция крахмала, гидролизуется быстрее, чем амилопектин, имеющий разветвленную структуру. Скорость гидролиза α-амилазой зависит от вида и состояния крахмала (нативный или клейстеризованный крахмал), а также от эффективности самих амилаз. На основании параллельно проводившихся опытов (в одних — действовали препаратами амилаз на клейстеризованный крахмал, а в других — эквивалентными концентрациями на нативные крахмальные зерна) было показано, что эффективность амилаз различного происхождения уменьшается в следующем порядке: панкреатическая, солодовая, бактериальная, грибная.

Характерной особенностью всех α-амилаз является наличие одного атома Са на молекулу фермента. Роль кальция состоит в том, что он стабилизирует вторичную и третичную структуру молекулы α-амилазы, обеспечивая, таким образом, ее каталитическую активность и вместе с тем предохраняя фермент от действия протеолитических ферментов и тепловой денатурации.

Различные α-амилазы отличаются по молекулярной массе, устойчивости к нагреванию и некоторым другим показателям. Молекулярная масса α-амилаз близка к 50000 Да, за исключением бактериальной α-амилазы, которая имеет молекулярную массу 96900 Да (кристаллический препарат). Так, например, широко применяемая в промышленности α-амилаза из плесневого гриба А. oryzae, полученная в кристаллическом виде, имеет молекулярную массу 51860 Да.

Большое практическое значение имеет влияние температуры и рН на стабильность амилаз. Быстрое разрушение зерновой α-амилазы при рН 3,3–4,0, например, дает возможность выпекать ржаной хлеб из муки, которая содержит избыток α-амилазы, при низких значениях рН, чтобы предотвратить излишнее декстринирование крахмала и образование клейких веществ в мякише хлеба.

Говоря о термостабильности α-амилаз различного происхождения, можно расположить их в следующем ряду по мере снижения устойчивости к нагреванию: бактериальные амилазы – зерновые амилазы – грибные амилазы.

Последними работами в области изучения амилаз показано, что в семенах растений присутствуют два типа α-амилазы: α-амилаза созревания и α-амилаза прорастания.

В созревающем зерне синтезируется α-амилаза созревания, которая затем переходит в латентную форму, локализуясь на мембранах алейронового слоя. Первый этап гидролиза крахмала при прорастании осуществляется этой α-амилазой. И только на следующем этапе в работу включается вновь синтезируемый фермент — α-амилаза прорастания. Ее синтез в клетках зародыша и алейронового слоя начинается при влажности зерна выше 28%. Две формы α-амилазы семян злаков различаются по термостабильности: α-амилаза созревания при 70⁰С теряет 50% своей активности, тогда как α-амилаза прорастания при этой температуре только незначительно снижает свою активность.

Интенсивность гидролиза крахмала в перерабатываемом сырье, как уже отмечалось ранее, определяется взаимодействием многих факторов. Это прежде всего состояние амилаз созревшего зерна и возможность перехода части латентной формы в свободное состояние. Это и состояние субстрата, его доступность действию фермента (атакуемость субстрата). Большое значение имеет и фракционный состав крахмальных гранул, соотношение мелких и крупных зерен, а также содержание поврежденных зерен крахмала, которые легче поддаются действию ферментов.

Как было установлено в последнее время, важная роль в этом процессе принадлежит протеолитическим ферментам. Протеазы, осуществляя ограниченное расщепление белков, способствуют освобождению амилаз из связанного состояния, а также гидролизуют ту часть запасных белков, которая прочно связана с поверхностью крахмальных гранул, облегчая, тем самым доступ фермента к субстрату.

Мощным механизмом регуляции скорости расщепления крахмальных гранул является система белковых ингибиторов амилаз, широко представленных в растениях. Ингибиторы белковой природы избирательно взаимодействуют с амилазами и образуют неактивные комплексы «амилаза – ингибитор». Высокой активностью обладают ингибиторы амилаз картофельного сока. Из зерна пшеницы выделен ингибитор с двумя активными центрами. Один активный центр имеет сродство к протеазам и способен блокировать их действие. Другой активный центр имеет сродство к амилазам. Таким образом, один ингибитор белковой природы способен блокировать работу, как протеаз, так и амилаз. В образующемся надмолекулярном комплексе ингибитор выполняет своеобразную роль связывающего звена, подавляя активность ферментов разного механизма действия.

β-Амилаза (Н.Ф. 3.2.1.2). β-Амилаза отщепляет мальтозу от нередуцирующего конца цепи, разрывая гликозидные связи через одну. Название «β-амилаза» было выбрано для того, чтобы показать, что мальтоза образуется в β-аномерной форме. Это не означает, что в молекуле крахмала присутствуют β-связи, а указывает скорее на то, что происходит инверсия конфигурации, которая может иметь место в процессе ферментативного превращения вещества, содержащего асимметрический атом углерода. Такая инверсия была открыта П. Вальденом в 1893 году и поэтому названа вальденовской инверсией.

Таким образом, действуя упорядочено, β-амилаза последовательно отщепляет остатки мальтозы с нередуцирующего конца до тех пор, пока не встретится точка ветвления со связью α-1,6. При этом амилоза под действием β-амилазы расщепляется до мальтозы на 100%, а при действии β-амилазы на амилопектин помимо образующейся мальтозы остается нетронутой крупная, сильно разветвленная сердцевина, так называемый «конечный декстрин», т.к. фермент прекращает свое действие за 2–3 остатка глюкозы от точек ветвления.

β-Амилазы — это ферменты в основном растительного происхождения. Хорошо известными источниками являются зерно пшеницы, а также пшеничный и ячменный солод, соевые бобы, клубни картофеля.

В отличие от α-амилазы, β-амилаза менее термостабильна, но проявляет большую устойчивость к кислым значениям рН, сохраняя свою активность при рН 3,3. Это нашло свое отражение в способе разделения α- и β-амилаз солода, где оба фермента присутствуют одновременно.

Глюкоамилаза (Н.Ф. 3.2.1.3). Глюкоамилаза продуцируется различ-ными видами микроскопических грибов рода Aspergillus: A. oryzae, A. niger, A. awamory и некоторыми другими, например, Rhizopus delamar и Rhizopus niveus. Эти ферменты расщепляют как амилозу, так и амилопектин до глюкозы, последовательно действуя с нередуцирующего конца цепи крахмала. Они способны гидролизовать α-1,4 и α-1,6 гликозидные связи.

Различные глюкоамилазы отличаются друг от друга скоростью гидролиза крахмала, отношением к температуре и рН и некоторыми другими показателями. На использовании препаратов грибной глюкоамилазы разработан ферментативный метод получения глюкозы.

β-Фруктофуранозидаза (Н.Ф. 3.2.1.26). Другие названия этого фермента — инвертаза, или сахараза. Для промышленного производства имеют значение только ферменты из S. cerevisiae и S. carlsbergensis. β-Фруктофура-нозидазу выделяют из дрожжей путем автолиза. В результате действия фермента на сахарозу получается смесь эквимолярных количеств α-глюкозы и β-фруктозы, получившая название «инвертного сахара». Термин «инверсия» обозначает изменения, происходящие в способности сахара вращать плоскость поляризованного света. Это можно выразить следующей схемой:

 

Сахароза + Н₂О → D-Глюкоза + D-Фруктоза

[α]_D = + 66,5^o [α]_D = + 52,5^o [α]_D = − 92,4^o

 

Оптимум рН дрожжевой инвертазы находится в достаточно широкой зоне от 4,0 до 5,5. Фермент ингибируется ионами металлов. Полное ингибирование происходит под действием ртути и свинца; частичное ингибирование вызывают ионы серебра, цинка, меди. β-Фруктофуранозидаза гидролизует также рафинозу и метил-β-D-фруктофуранозид, причем, если относительную скорость гидролиза сахарозы принять за 100, то соответствующие скорости расщепления этих субстратов будут равны 47 и 77.

Инвертаза находит широкое применение в пищевой промышленности. Гидролиз концентрированных растворов сахарозы приводит к образованию более сладких сиропов. Точка кипения инвертированных сиропов выше, а точка замерзания ниже, т.к. при инверсии повышается осмотическое давление. Инвертаза применяется в кондитерской промышленности для производства отливных помадных корпусов конфет, круглых помадных корпусов и жидких фруктовых начинок, таких как вишневый ликер. В каждом случае ее применение обусловлено необходимостью получить полумягкую или жидкую консистенцию при высоких концентрациях сахара (78%), предотвращающих брожение.

β-Галактозидаза (Н.Ф. 3.2.1.23). Фермент, который часто называют лактазой, катализирует реакцию гидролитического отщепления нередуцирующих остатков β-D-галактозы в β-галактозидах, в частности, в молочном сахаре — дисахариде лактозе:

Ферментные препараты лактазы, применяемые в пищевой промышленности получают с помощью различных продуцентов: микроскопических грибов (A. oryzae, A. niger), бактерий (E.coli, Lactobacillus), дрожжей (S. fragilis, S. psedotropicalis). Все они имеют различные температурные оптимумы, которые, однако, лежат в пределах 37⁰–50⁰С. Оптимумы рН этих ферментов также заметно отличаются: для бактериальных около 7,0; для грибных около 5,0; для дрожжевой лактазы около 6,0.

При гидролизе лактозы в цельном молоке, обезжиренном молоке или в концентратах молока оптимальную активность (при нейтральном рН этих субстратов) проявляет дрожжевой фермент; для сыворотки и его концентратов — грибной. Причем в обезжиренном молоке или сыворотке лактоза гидролизуется легче, чем в цельном, а пастеризованные субстраты гидролизуются легче, чем непастеризованные.

β-Галактозидаза из E.coli была получена в кристаллическом состоянии, ее молекулярная масса 850000 Да. Она ингибируется некоторыми металлами (Cu, Zn). Восстанавливающие агенты (цистеин, сульфид Na, сульфит Na и др.) активируют фермент и способны преодолевать влияние ингибиторов-метал-лов.

Эндополигалактуроназа (Н.Ф. 3.2.1.15) и экзополигалактуроназа (Н.Ф. 3.2.1.67). Эти два фермента участвуют в превращениях пектиновых веществ наряду с другими пектолитическими ферментами растительного и микробного происхождения.

Эндополигалактуроназа — фермент, который гидролизует α-1,4-связи в молекуле растворимого пектина (метоксилированной полигалактуроновой кислоты), неупорядоченным, произвольным образом. С возрастанием степени этерификации полигалактуроновой кислоты, степень и скорость гидролиза падают, т.к. для проявления каталитической активности фермента, требуются свободные карбоксильные группы. Большинство изученных эндополигалактуроназ мироскопических грибов имеют молекулярную массу от 30000 до 40000 Да. Оптимальные значения рН колеблются в диапозоне 3,8–5,5.

В гидролизе этого типа связи принимает участие и другой фермент — экзополигалактуроназа, который последовательно отщепляет молекулу галактуроновой кислоты, начиная с нередуцирующего конца. Эндополигалактуроназа синтезируется как грибами, так и некоторыми видами бактерий. Они отличаются по своей специфичности к пектинам из различных источников, конечными продуктами реакции, оптимуму рН и другим свойствам.

Для промышленного производства ферментных препаратов пектолитических ферментов, которые являются комплексными, в качестве продуцентов используют в основном микроскопические (плесневые) грибы, в частности, грибы рода Aspergillus: A. niger, A. wentii, A. oryzae. Бактериальные ферменты в промышленных масштабах не производятся.

Растительные полигалактуроназы, по-видимому, похожи на грибные полигалактуроназы. Они обнаружены в широком спектре плодов и овощей: помидорах, авокадо, редисе, огурцах, яблоках, грушах, цитрусовых и др. Все они проявляют активность при естественных рН плодов.

Применение препаратов пектолитических ферментов в промышленности достаточно обширно. Они используются при производстве фруктовых соковых концентратов и экстрактов, при осветлении соков и вин, при производстве фруктовых и овощных пюре и нектаров.

Целлюлолитические ферменты. Ферментативное разрушение целлюлозы и родственных ей полисахаридов (гемицеллюлозы, лигнина) -- сложный процесс, требующий участия комплекса ферментов. Продуцентами такого комплекса целлюлолитических ферментов являются грибы рода Trichoderma, Phanerochaete (Sporotrichum) и Fusarium, а также бактерии рода Clostridium, Cellulomonas и некоторые другие.

Три основных типа целлюлолитических ферментов, продуцируемых микроскопическими грибами, образуют комплекс ферментов, способных осуществить полный гидролиз целлюлозы:

§ Эндо-1,4-β-глюканаза, или целлюлаза, (Н.Ф. 3.2.1.4) беспорядочно гидролизуетβ-1,4-гликозидные связи. Она не расщепляет целлобиозу, но гидролизует целлодекстрины и производные целлюлозы с высокой степенью замещения, т.к. специфичность этого фермента не высока.

§ Экзо-1,4-β-глюканаза, или целлобиогидролаза, (Н.Ф. 3.2.1.91) действует на целлюлозу, отщепляя целлобиозные звенья с нередуцирующего конца цепи. Этот фермент не действует на замещенные производные целлюлозы, что указывает на более высокую субстратную специфичность, чем у эндоглюконазы. Целлобиогидролаза гидролизует целлодекстрины, но не действует на целлобиозу.

§ β-глюкозидаза (Н.Ф. 3.2.1.21) расщепляет целлобиозу и целлооли-госахариды до глюкозы. Фермент не действует на целлюлозу и высшие олигосахариды.

Целлюлазная система бактерий существенно проще, чем у грибов, т.к. бактерии образуют только эндоглюканазу иβ-глюкозидазу.

Все ферменты целлюлолитического комплекса достаточно хорошо изучены: практически все они являются гликопротеидами, определены их молекулярные массы, изоэлектрические точки, для многих показано наличие множественных форм.

Доказано, что различные ферменты, гидролизующие высокоупорядоченную целлюлозу, действуют в синергизме. Эндоглюканаза атакует аморфные участки целлюлозных фибрилл. В результате образуются новые целлюлозные цепочки, на которые действует целлобиогидролаза, отщепляя целлобиозные звенья с нередуцирующего конца. Синергизм между двумя этими ферментами проявляется в том, что в результате действия эндоглюканазы появляется новый субстрат (более короткие цепочки), на который действует уже целлобиогидролаза. β-Глюкозидаза усиливает гидролиз, расщепляя целлобиозу — конечный продукт и ингибитор этих ферментов.

Применение целлюлолитических ферментов представляет большой интерес, т.к. ферментативный гидролиз целлюлозосодержащих материалов (древесина, торф, сельскохозяйственные и городские отходы) мо<