Глава 7. Ферментативные методы анализа пищевых

Продуктов

 

Ферментативный анализ представляет собой один из основных аналитических инструментов в международной и отечественной практике научных исследований, современного производственного и сертификационного контроля качества продуктов питания, пищевого сырья и биологических материалов.

Ферментативный анализ является составной частью энзимологии и аналитической химии и служит для специфического определения веществ с помощью высокоочищенных препаратов ферментов.

В основе ферментативного анализа лежат природные биохимические процессы обмена веществ, которые воспроизводятся in vitro: реакция фермента с субстратом, причем в качестве субстрата выступает анализируемое вещество пробы.

Основными преимуществами применения ферментативных методов в научных исследованиях при разработке новых пищевых технологий и биотехнологических процессов, а также при анализе качества, идентификации и установления фальсификации продуктов питания и пищевого сырья являются:

§ высокая специфичность и достоверность результатов. Высокоспецифичные ферментативные методы анализа дают, как правило, более достоверные результаты, чем неспецифические химические методы. Специфичность действия ферментов, основанная на комплементарности пространственной конфигурации активного центра и субстрата, является гарантом достоверности и надежности ферментативного метода при исследовании отдельных соединений в многокомпонентных смесях, имеющих сложный состав и строение, таких, какими и являются пищевые продукты.

При разработке ферментативных методов и подборе реагентов, в первую очередь, выбирают ферменты с наибольшей специфичностью действия, для которых подбираются оптимальные условия проведения анализа. Кроме того, при разработке методов ферментативного анализа отдельных компонентов продуктов питания обычно используют несколько ферментов, которые последовательно функционируют в данной системе.

§ простые способы подготовки проб, которые исключают потерю исследуемых компонентов. Основная задача, которую необходимо выполнить при подготовке пробы — по возможности наиболее полно сохранить для анализа исследуемый компонент без его количественной потери или изменения структуры. В некоторых случаях возможен прямой анализ пробы без ее предварительной подготовки (например, при абсолютной специфичности фермента к исследуемому веществу и отсутствии в пробе каких-либо мешающих факторов). Обычно же для ферментативного анализа используются простые и хорошо известные способы подготовки проб, такие как разбавление, фильтрация (центрифугирование), нейтрализация (подкисление), экстракция, обезжиривание, осветление, обесцвечивание. Только в определенных случаях применяют специальные способы подготовки проб, например, при определении водонерастворимых соединений (холестерин, лецитин, крахмал), нестабильной L-аскорбиновой кислоты в твердых материалах и др.

§ простая и быстрая процедура изменений, которая исключает использование долгосрочного оборудования. В большинстве ферментативных определений используют фотометрические способы измерения результатов. Для этого все компоненты искусственной тестовой системы, например, буфер, коферменты, активаторы, вспомогательные ферменты и пробу смешивают в фотометрической кювете. После измерения начальной оптической плотности добавляют стартовый фермент, который инициирует реакцию. В конце реакции (через определенный промежуток времени) повторно измеряют оптическую плотность тестовой системы. Из разницы оптических плотностей в начале и в конце реакции по уравнению закона Ламберта–Бера рассчитывают концентрацию С (г/л) искомого соединения:

 

,

 

где (Е₂ – Е₁)_опыт — разница конечной и начальной оптической плотности в кювете с пробой;

(Е₂ – Е₁)_{контроль} — разница конечной и начальной оптической плотности в кювете без пробы;

V — общий объем реакционной смеси, мл;

M — молярная масса искомого соединения, г/моль;

F — фактор разведения пробы;

ε — молярный коэффициент оптической активности соединения реакционной смеси, например, кофермента НАДФ⁺, НАД⁺ при λ = 340 нм, ε = 6,3 л/ммоль · см);

d — толщина кюветы, см;

v — объем пробы, добавляемый в кювету, мл.

 

В большинстве ферментативных методов прямому фотометрическому контролю доступно измерение таких вспомогательных компонентов тестовой системы, как коферментов НАД⁺/НАД·Н или НАДФ⁺/НАДФ·Н. Количество восстановленных или окисленных коферментов прямо пропорционально количеству искомого соединения. Система конечных значений с фотометрическим измерением результата настолько надежна, что служит в качестве стандарта для оценки других методик.

Для проведения ферментативного анализа используется стандартное оборудование, которое имеется практически в любой производственной лаборатории: спектрофотометры или фотометры с интервалом измерений от 325 до 800 нм, кюветы для фотометрических измерений, мерные пипетки и дозаторы, весы, центрифуга, рН-метр, водяной термостат, фильтры и т.п.

§ высокая чувствительность метода и хорошая воспроизводимость результатов. Высокая чувствительность позволяет использовать ферментативные методы для определения следовых количеств веществ. Например, в продуктах питания могут быть определены следующие концентрации компонентов: этанол — 0,001 г/л; ацетоальдегид — 0,001 г/л; лимонная кислота — 0,002 г/л; глицерин — 0,001 г/л; D-глюкоза — 0,002 г/л; D-сорбит — 0,001 г/л; лактоза — 0,005 г/л; нитраты — 0,001 г/л.

 

Кроме выше перечисленных достоинств ферментативных методов анализа можно назвать и универсальность применения, высокую надежность и устойчивость к мешающим факторам, низкие затраты на проведение анализа (время, оборудование, расходуемые материалы), а также использование безопасных реактивов.

Области применения ферментативного анализа на практике многообразны. Это и производственный контроль, и контроль качества готовой продукции, а также контроль сырья, анализ состава пищевого продукта с целью установления их свойств и соответствия законодательным нормам, оценка гигиенического статуса, идентификация и установление фальсификации.

В таблице 4 приведены некоторые группы продуктов питания, а также их компоненты, для анализа которых разработаны специфические ферментативные методы.

 

Таблица 4. Применение ферментативных методов для анализа различных компонентов пищевых продуктов

Группа продуктов	Анализируемые компоненты
Детское питание, диетические продукты     Пиво, вино, игристые вина     Хлеб, хлебобулочные изделия, шоколад, мороженное и кондитерские изделия	Сахароза, D-глюкоза, D-фруктоза, лактоза, мальтоза, крахмал, L-аскорби-новая кислота, лимонная кислота, D-, L-молочные кислоты, D-сорбит, ксилит, лецитин, холин D-глюкоза, D-фруктоза, сахароза, глюкозный сироп, этанол, глицерин, D-сор-бит, сульфит, нитраты, L-, D-молочные кислоты, D-глюконовая кислота, уксусная кислота, лимонная кислота, янтарная кислота, L-аскорбиновая кислота Сахароза, D-глюкоза, D-фруктоза, лактоза, мальтоза, крахмал, этанол, глицерин, D-сорбит, ксилит, холестерин, лецитин

Окончание таблицы 4

Яйца и яичные продукты     Соки, фруктовые продукты, безалкогольные напитки     Мясо и мясные продукты   Молоко и молочные продукты     Пищеконцентраты (например, супы)   Сахар и сахаристые изделия

Янтарная кислота, L- молочная кислота, D-3-гидроксимасляная кислота, холестерин Сахароза, D-глюкоза, D-фруктоза, лимонная кислота, D-изолимонная кислота, L-аскорбиновая кислота, D-, L-мо-лочные кислоты, этанол, уксусная кислота, глюкозный сироп, щавелевая кислота, глицерин, D-, L-яблочные кислоты, муравьиная кислота, D-глюконовая кислота, D-сорбит, нитраты Сахароза, лактоза, D-глюкоза, D-галак-тоза, крахмал, лимонная кислота, уксусная кислота, D-глюконовая кислота, L-глутаминовая кислота, D-, L-молоч-ные кислоты, муравьиная кислота, глицерин, аммиак (мочевина), креатин/креатинин, пирофосфаты, холестерин Лактоза, D-глюкоза, D-фруктоза, D-га-лактоза, крахмал, сахароза, лимонная кислота, уксусная кислота, L-яблочная кислота, янтарная кислота, L-глутами-новая кислота, D-, L-молочные кислоты, этанол, ацетоальдегид, триглицериды, мочевина, нитраты Креатинин, L-глутаминовая кислота, сахароза, крахмал Сахароза, D-глюкоза, D-фруктоза, рафиноза, муравьиная кислота, лимонная кислота, D-, L-молочные кислоты, этанол, D-сорбит

Источник: Колеснов А. Ю. Ферментативный анализ в пищевой промышленности //

Пищевая промышленность, 1996, № 11.

 

По словам одного из основоположников ферментативного анализа Г. Бергмана: «Ферментативный анализ, как принцип, свободен от недостатков и ошибок, так как он представляет систему для измерений, которую успешно использует живая клетка уже в течение миллионов лет».

Контрольные вопросы

1. Что такое ферменты, какова их химическая природа?
2. В чем заключаются особенности ферментов, как биологических катализаторов?
3. Какие факторы влияют на активность ферментов?
4. Как определяют начальную скорость ферментативной реакции? Почему начальная скорость является мерой количества фермента?
5. На чем основана классификация ферментов?
6. Дайте краткую характеристику каждому классу ферментов.
7. Что такое ферментные препараты и чем они отличаются от ферментов?
8. Какова роль ферментов — оксидоредуктаз при хранении и производстве пищевых продуктов?
9. Какова роль гидролитических ферментов при хранении и производстве пищевых продуктов?
10. Какие ферменты наиболее широко применяются в пищевой промышленности? Приведите примеры.

 

 

Список рекомендуемой литературы

 

1. Бекер М. Е. Введение в биотехнологию. – М.: Пишевая промышленность, 1978. – 229 с.

2. Берхард С. Структура и функции ферментов. – М.: Мир, 1971. – 334 с.

3. Витол И. С., Кобелева И. Б., Траубенберг С. Е. Ферменты и их применение в пищевой промышленности. – М.: ИК МГУПП, 2000. – 80 с.

4. Грачева И. М., Кривова А. Ю. Технология ферментных препаратов. – М.: Элевар, 2000. – 521 с.

5. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты: в 3 т., 3-е изд. – М.: Мир, 1982. – 1120 с.

6. Жеребцов Н. А., Корнеева О. С., Фараджаева Е. Д. Ферменты: их роль в технологии пищевых продуктов. – Воронеж: Изд-во ВГУ, 1999. – 120 с.

7. Иванова Л. А., Войно Л. И., Иванова И. С. Пищевая биотехнология. Кн. 2: Переработка растительного сырья. – М.: КолосС, 2008. – 472 с.

8. Кислухина О. В. Ферменты в производстве пищи и кормов. – М.: ДеЛи принт, 2002. – 336 с.

9. Колеснов А. Ю. Биохимические системы в оценке качества продуктов питания. – М.: Пищевая пром-сть, 2000. – 414 с.

10. Кретович В. Л. Введение в энзимологию. – М.: Наука, 1986. – 332 с.

11. Микробные ферменты в биотехнологии / Под ред. М. В. Фогарти. – М.: Агропромиздат, 1986. – 318 с.

12. Нечаев А. П., Траубенберг С. Е., Кочеткова А. А., Колпакова В. В., Витол И. С., Кобелева И. Б. Пищевая химия. – СПб.: ГИОРД, 2012. – 672 с.

13. Номенклатура ферментов. Рекомендации Международного биохимического союза. – М., 1979. – 319 с.

14. Рид Д. Ферменты в пищевой промышленности. – М.: Пищевая пром-сть, 1971. – 414 с.

15. Рогов И. А., Антипова Л. В., Дунченко Н. И. Химия пищи. – М.: КолосС, 2007. – 853 с.

16. Техническая биохимия / Под ред. В. Л. Кретовича. – М.: Высшая школа, 1973. – 456 с.

17. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. – М.: Мир, 1983. – 213 с.

18. Уэстли Дж. Ферментативный катализ. – М.: Мир, 1972. – 270 с.

19. Ферментные препараты в пищевой промышленности / Под ред. В. Л. Кретовича. – М.: Пищевая пром-сть, 1975. – 515 с.

 

Содержание

 

Введение….………………………………………………………………………..2

 

Глава 1. Общие свойства ферментов и факторы, влияющие на скорость

биохимических процессов…….………………………………………..3

 

Глава 2. Классификация ферментов……………………………………………..9

 

Глава 3. Ферментные препараты………………………………………………..11

 

Глава 4. Роль ферментов в производстве и хранении пищевых

продуктов……………………………………………………………….15

 

Глава 5. Применение ферментных препаратов в пищевых

технологиях…………………………………………………………….40

 

Глава 6. Иммобилизованные ферменты………………………………………..58

 

Глава 7. Ферментативные методы анализа пищевых продуктов……………..65

 

Контрольные вопросы……………………………………………………………70

 

Список рекомендуемой литературы…………………..………………………..71

 

[1] Дыхательный коэффициент — отношение выделившейся при дыхании СО₂ к количеству поглощенного О₂.