Питательные среды для культур клеток

10)МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ. ЭКСПРЕСС ДИАГНОСТИКА. Лабораторная диагностика вирусных инфекций складывается из 3-х методических направлений:

– Экспресс-диагностика. Обнаружение возбудителя (АГ) или его компонентов непосредственно в клиническом материале, взятом от больного (быстрая диагностика).

– Вирусологический метод. Выделение вируса из клинического материала путем культивирования на биологических объектах, его индикация и идентификация.

– Ретроспективная диагностика. Серодиагностика вирусных инфекций (определение антител к возбудителю).

Быстрая диагностика вирусных инфекций (Экспресс-метод)

Быстрая диагностика позволяет обнаружить вирус или его компоненты непосредственно в пробах, взятых от больного, и дать ответ через несколько часов. С помощью экспресс-метода можно выявить сам антиген (возбудитель), тельца-включения, гемагглютинины вируса.

Возбудитель (АГ) может быть выявлен в пораженной ткани с помощью флюоресцирующих антител. Наиболее широко используют РИФ. Для этого из патматериала готовят мазки, отпечатки или срезы, которые обрабатывают люминесцентными сыворотками и просматривают в люминесцентноммикроскопе. Этот метод отличается быстротой и высокой чувствительностью. Однако результаты РИФ требуют подтверждения другими методами, так как встречаются случаи неспецифического свечения.

Для выявления возбудителя используют и другие иммунологические реакции, такие как ИФМ (ИФА), РСК, РДП.

Вирионы вирусов можно определять при электронной микроскопии и вирусоскопии.

Тельца-включения и элементарные тельца можно выявить в патологическом материале, используя специальные методы окраски.

У гемагглютинирующих вирусов вирусные гемагглютинины можно обнаружить с помощью реакции гемагглютинации (РГА). Гемагглютинин–это белок, который располагается в оболочке вируса. Гемагглютинация–это склеивание эритроцитов с помощью вируса (АГ). Механизм его состоит в том, что одна вирусная частица при помощи своего гемагглютинина адсорбируется одновременно на двух эритроцитах, образуя мостик между ними, в результате чего эритроциты склеиваются между собой и выпадают в осадок в виде раскрытого зонтика.
11)ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУР КЛЕТОК:

В зависимости от техники приготовления культуры клеток классифицируют на:

- однослойные – клетки способны прикрепляться и размножаться на поверхности химически нейтрального стекла или пластика.

- суспензионные – клетки размножаются во всем объеме питательной среды при ее перемешивании.

- органные - цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру вне организма (применение ограничено).

Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить в зависимости от числа жизнеспособных генераций на

1) первичные (первично трипсинизированные),

2) полуперевиваемые (диплоидные)

3) перевиваемые.

По происхождению они классифицируются на эмбриональные, опухолевые и из взрослых организмов.

По морфогенезу - на фибробластные, эпителиальные и др.

Первичные культуры клеток - это клетки какой-либо ткани человека или животного, которые имеют способность расти в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности, покрытой специальной питательной средой. Срок жизни таких культур ограничен. В каждом конкретном случае их получают из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток. Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.

Полуперевиваемые (или диплоидные) культуры клеток - клетки одного типа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин. Чаще всего используют культуры фибробластов эмбриона человека (WI-38, MRC-5, IMR-9), коров, свиней, овец и т.д.

Перевиваемые клеточные линии характеризуются потенциальным бессмертием и гетероплоидным кариотипом. Источником перевиваемых линий могут быть первичные клеточные культуры (например, СОЦ – сердце обезьяны цинамобус, ПЭС – почки эмбриона свиньи, ВНК-21 - из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС - из почки морской свинки, Vero – почка зеленой обезьяны и др.) отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению из клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур - трансформированными. Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Наиболее часто в вирусологической практике применяются такие линии перевиваемых клеток: HeLa - получена из карциномы шейки матки; Нер-2 - из карциномы гортани; Детройт-6 - из метастаза рака лёгкого в костный мозг; RH - из почки человека, КВ – карцинома ротовой полости, RD – рабдомиосаркома человека.

Культуры органов – представляют собой приготовленные в стерильных условиях срезы органов животных, которые на протяжении определенного срока (дни, недели) сохраняют свою жизнедеятельность в особенных условиях культивирования