Лабораторная работа 1. Изучение кинетики гибели микроорганизмов

Цель и задачи работы: определить основные показатели, которые характеризуют эффективность термической стерилизации и обеспечивают заданную степень асептики.

 

Гибель части клеток в процессе роста популяции учитывается большинством моделей как процесс, протекающий параллельно и независимо от размножения жизнеспособных особей той же культуры.

В ряде случаев, а именно при стерилизации жидких и твердых сред, оборудования, вспомогательных материалов, гибель части или всех клеток становится целью процесса.

Такая постановка задачи требует таких методов решения, которые способны гарантировать заданную степень асептики и воспроизводить результаты в промышленных условиях при длительной эксплуатации установок.

Основным методом стерилизации жидкостей и аппаратуры в лабораторных условиях является термический, связанный с достаточно длительным прогревом до заданной температуры.

Гибель микроорганизмов при повышенной температуре происходит, как правило, со скоростью, пропорциональной концентрации клеток или спор, еще сохранивших жизнеспособность к данному моменту времени:

Если в начальный момент времени при τ = 0 концентрация жизнеспособных особей составляла[ х_о ], то ко времени τ она достигает величины:

    (*),         откуда   ,      (1.1)

где k – удельная скорость гибели,

  ln критерий стерилизации.

Практически важной характеристикой оказывается время, за которое концентрация выживших клеток снижается в 10 раз.

Из уравнения (*): τ ₁₀=2,303/ к.

При стерилизации жидких сред обычно задается величина критерия стерилизации.

Затем по известному значению уд. скорости гибели при определенной температуре по уравнению (*) вычисляют необходимую продолжительность обработки τ.

Гибель клеток и спор резко ускоряется с ростом температуры.

В интервале 100-140 ^о С удельная скорость гибели клеток k возрастает в 10⁴-10⁵ раз, при повышении температуры на 10^о С удельная скорость гибели клеток и спор возрастает в 10 раз и более.

Зависимость удельной скорости гибели клеток от температуры описывается уравнением Аррениуса:

k = А· exp ^{- E / RT}                                            (1.2)

Постоянную E в этом уравнении по аналогии с химической кинетикой называют энергией активации процесса гибели микроорганизмов.

 

Объекты исследования, оборудование, реактивы и посуда:

- суспензия дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) в объеме 500 мл на каждое занятие;

- микроскопы – 5 шт.;

- камера Горяева-Тома – 5 шт.;

- водяная баня (термостат) – 1-2 шт.;

- краситель (метиленовый синий);

- пробирки (5 шт. на бригаду);

- мерные цилиндры объемом 10 мл (5 шт.);

- пипетки объемом 1 или 2 мл (5 шт.);

- фильтровальная бумага;

- марлевые салфетки

Экспериментальная часть

1. Разлить исходную суспензию микроорганизмов по 3-5 мл в пробирки.

Примечание: в качестве точки отсчета оставить нулевую пробу.

2. Каждой бригаде поместить 4 пробирки в термостат (или в водяную баню) и установить заданную температуру эксперимента (t = 65^о C, 85^о С и 100^о С).

3. Через определенные промежутки времени (15 минут) отобрать пробы.

4. Проанализировать количество клеток в объеме среды методом простого окрашивания и подсчета в счетных камерах Горяева-Тома.

 

Подсчет клеток в счетных камерах

 

Этот метод рекомендуется использовать для подсчета крупных объектов – дрожжей, одноклеточных водорослей, конидий грибов и некоторых относительно крупных бактерий. Обычно используют камеру Горяева-Тома (рис. 1.2), хотя можно применять и другие.

Эта камера представляет собой толстое предметное стекло, разделенное бороздками. На центральную часть стекла нанесена сетка. Площадь квадрата сетки указана на одной из сторон предметного стекла и соответствует 1/25 мм² (большой квадрат) или 1/400 мм² (малый квадрат). Часть предметного стекла, на 0,1 мм ниже двух других сторон. Это глубина камеры, она всегда указывается на предметном стекле.

 

 

 

                        а

 

                        h                                         в

 

 

                        б

а – вид сверху; б – вид сбоку;

в – вид сетки камеры при малом увеличении микроскопа

 

Рис. 1.2 – Камера Горяева-Тома

 

При работе с камерой необходимо соблюдать определенный порядок ее заполнения. Вначале углубление с сеткой покрывают специальным шлифованным покровным стеклом и, слегка прижимая, смещают покровное стекло в противоположные стороны до появления колец Ньютона. Это указывает на то, что покровное стекло притерто к сторонам камеры. Только при таком условии объем взвеси микроорганизмов, находящихся в камере, соответствует расчетному. Суспензию вносят через бороздку камеры капилляром или пипеткой.

Подсчет клеток рекомендуется начинать через 3-5 минут после заполнения камеры, чтобы клетки осели и при микроскопировании были видны в водной плоскости. Подвижные клетки перед заполнением камеры убивают нагреванием или суспендированием в 0,5 % -ном водном растворе формалина. Число клеток подсчитывают с объективом 8× или 40×. С иммерсионным объективом работать нельзя, так как его фокусное расстояние меньше толщины стекла камеры. Обычно подсчитывают клетки микроорганизмов в 10 больших или 20 маленьких квадратах сетки, перемещая последние по диагонали. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также клетки, пересекающие верхнюю и правую сторону квадрата. При подсчете количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом – 10, в противном случае исходную суспензию разводят водопроводной водой. Для получения достоверного результата общее число подсчитанных клеток микроорганизмов должно быть не менее 600.

Точность определения зависит от того, насколько плотно пришлифовано покровное стекло к поверхности камеры, поэтому подсчет клеток повторяют 3-4 раза, каждый раз заново монтируя камеру и заполняя ее исследуемой взвесью микроорганизмов. Это обеспечивает большую точность, чем подсчет 600 клеток при однократном монтаже камеры. Количество клеток в 1 мл исследуемой суспензии вычисляют по формуле:

,

где   х – число клеток в 1 мл суспензии;

а – среднее число клеток в квадрате сетки;

h – глубина камеры в мм;

S – площадь квадрата сетки в мм²;

10³ – коэффициент перевода см³ в мм³;

n – разведение исследуемой суспензии.

Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов, из которых 25 разделены на 16 малых квадратов, 100 – на прямоугольники и 100 остаются чистыми.

Каждая их 15 вертикальных и горизонтальных полос сетки Горяева имеет ширину, равную 1/5 мм, причем каждая третья полоса разделена в свою очередь на 4 узкие полоски шириной 1/20 мм, при пересечении которых образуются маленькие квадратики площадью 1/400 мм². Они составляют 25 групп из 16 квадратиков. Для подсчета используются большие квадраты, разделенные на 16 маленьких.

 

Расчетная часть

Оценить эффективность термической стерилизации. Для этого:

1. Вычислить х – число клеток в 1 мл суспензии микроорганизмов и построить графическую зависимость х = f(τ);

2. Вычислить критерий стерилизации ln ;

3. Определить удельную скорость гибели (k) микроорганизмов при заданной температуре (Т = 65^о, 85^о, 100^оС) по уравнению (1.1);

Результаты экспериментальных данных и расчетов представить в виде таблицы 1.3.

 

Таблица 1.3 – Экспериментальные данные и показатели термической стерилизации

№ пробы	τ, мин.	а	х	ln ;	k, мин -1
0	0
1	15
2	30
3	45
4	60

4. Построить графическую зависимость в координатах ln k = f (1/ T) (Т приводится в градусах Кельвина).

 

ln k

        ln A

 

 

                   α

 

 

                                              1/ T

 

Рис. 1.3 – Графическая зависимость k от 1/ Т

Из графика (рис. 3.1) найти tgα и точку пересечения с осью ординат. В линеаризованном виде уравнение Аррениуса может быть записано как

    ln k = ln A - E / RT                                      (1.3)

Здесь ln A определяется из графика как величина, численно равная величине отрезка, отсекаемого прямой на оси ординат, а .

Таким образом, значение удельной скорости гибели определяется из уравнения Аррениуса с найденными константами: А и Е/ R.

Эффективность стерилизации может быть оценена для любой температуры: так как А, Е, R – постоянные величины, подставив в уравнение Аррениуса (1.3) любое значение Т, рассчитывается k.

5. Определитьтемпературу, которая гарантирует заданную степень асептики;

6. Рассчитать время, за которое концентрация выживших клеток снижается в 10 раз.

Сделать обобщающие выводы по полученным экспериментальным данным и результатам расчетов.

 

Контрольные вопросы

 

1. Асептика, асептические условия, стерильность.

2. Какое влияние оказывает посторонняя микрофлора на эффективность микробиологических производств? Приведите примеры.

3. Каким образом обеспечивается достижение и поддержание асептических условий на стадии ферментации?

4. Термическая стерилизация.

5. Химическая стерилизация.

6. Стерилизация ионизирующим излучением.

7. Фильтрующая стерилизация.

8. Проанализируйте существующие способы и режимы стерилизации. Какие пути повышения эффективности режимов стерилизации жидкостей вы знаете?

9. Методы и режимы получения стерильного воздуха.

 

 

Литература

 

1. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. – М.: КолосС, 2004. – 296 с.

2. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. – С-Пб.: Наука, 1995. – 600 с.

3. Кантере В.М. Теоретические основы технологии микробиологических производств. – М.: Агропромиздат, 1990. – 271 с.

4. Манаков М.Н., Победимский Д.Г. Теоретические основы технологии микробиологических производств. – М.: Агропромиздат, 1990. – с. 210-213.

5. Матвеев В.Е. Научные основы микробиологической технологии. – М.: Агропромиздат, 1985. – 224 с.

6. Матвеев В.Е. Основы асептики в технологии чистых микробиологических препаратов. – М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1981. – 312 с.

7. Биотехнология: уч. пособие для вузов. В 8 кн. / Под ред. Н.С. Егорова; В.Д. Самуилова. Кн. 1. – М.: Высшая школа, 1987. – 159 с.

8. Беккер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. – М.: Агропромиздат, 1990. – 334 с.

9. Промышленная микробиология / Под ред. Н.С. Егорова. – М.: Высшая школа, 1989. – 688 с.