Практическое использование биохимической активности м/о в микробиологической промышленности и медицинской микробиологии

Ферменты бактерий. Химическая природа. Экзо- и эндоферменты, их значение в метаболизме клетки. Конститутивные и Индуцибельные ферменты. Примеры. Классы ферментов: оксидоредуктазы; трансферазы; гидролазы; лиазы; изомеразы; лигазы (синтетазы).

Все обменные процессы в бактериальной клетке идут с участием ферментов (энзимов). Ферменты выполняют функцию биокатализаторов. Они представляют собой простые или сложные белки. Принято различать экзоферменты и эндоферменты. Экзоферменты выделяются микробной клеткой во внешнюю среду. Часть экзоферментов связана с питанием бактерий, так как они расщепляют питательные вещества до такой формы, которая способна усваиваться микробной клеткой. Эндоферменты участвуют в разложении питательных веществ внутри клетки и в превращении их в составные части клетки.

Одни ферменты синтезируются бактериальной клеткой постоянно (конститутивные ферменты), другие ферменты синтезируются только при контакте с определенным субстратом (индуцибельные ферменты). В частности, конститутивными ферментами являются ферменты гликолиза – ферменты окисления глюкозы (гексокиназа, глюкозоизомераза, альдолаза и др.). Индуцибельными ферментами являются бета-галактозидаза (катализирует расщепление лактозы на глюкозу и галактозу) и бета-лактамаза (расщепляет бета-лактамные антибиотики).

Все ферменты подразделяются на шесть классов:

1. оксидоредуктазы;

2. трансферазы;

3. гидролазы;

4. лиазы;

5. изомеразы;

6. лигазы (синтетазы).

Оксидоредуктазы – это ферменты, которые катализируют окислительно- восстановительные реакции и встречаются во всех живых клетках. Их основная функция – обеспечение организма энергией в доступной для использования форме. Важнейшими представителями оксидоредуктаз являются дегидрогеназы, оксидазы, пероксидазы, гидроксилазы, оксигеназы, каталаза. При идентификации бактерий в основном используют методы выявления каталазы и цитохромоксидазы.

Каталаза разлагает пероксид водорода на воду и молекулярный кислород. Этот фермент выявляют по образованию пузырьков кислорода после смешивания микробной суспензии с 1% раствором перекиси водорода на стекле или после нанесения раствора перекиси водорода на культуру, выросшую на поверхности плотной питательной среды.

Цитохромоксидаза окисляет молекулы цитохрома С, восстанавливая кислород. Цитохромоксидазу обнаруживают смачиванием бумажки специальным реактивом (1% спиртовый раствор α-нафтола; 1% водный раствор N-диметил-β- фенилендиамина дигидрохлорида). Нанесение на бумажку капли суточной культуры бактерий приводит к появлению синего окрашивания.

Трансферазы    – ферменты, которые катализируют перенос отдельных радикалов (РО₃, Н₂, СН₃), частей молекул или целых атомных группировок от одних соединений  к другим. К трансферазам относятся ацетилтрансфераза, фосфотрансфераза, аминотрансфераза,  метилтрансфераза.   Эти                     ферменты в повседневной лабораторной практике не определяют.

Гидролазы – ферменты, которые катализируют реакции расщепления и синтеза белков, жиров и углеводов с участием воды. К этому классу ферментов относятся пептидогидролазы или протеазы - ферменты, расщепляющие белки; гидролазы гликозидов или гликозидазы, расщепляющие гликозиды (β- фруктофуранозидаза, α-глюкозидаза, β-галактозидаза); эстеразы, катализирующие расщепление сложных эфиров (липаза, фосфатаза). При идентификации бактерий в первую очередь изучают ферменты, расщепляющие углеводы и белки. Способность бактерий расщеплять углеводы, называется сахаролитической активностью, а способность расщеплять белки – протеолитической активностью. При ферментации сахаров выявляют образование кислоты (молочной, уксусной, муравьиной) или кислоты и газа (углекислого газа, водорода), а при распаде белков – образование щелочей, сероводорода, индола, аммиака.

Для выявления гликозидаз используют жидкие или полужидкие среды Гисса.

Протеазы бактерий выявляют при посеве чистой культуры на специальные питательные среды (мясо-пептонный желатин - МПЖ, молочный агар, мясо- пептонный бульон – МПБ). Результат оценивают по разжижению желатина, разложению казеина молока вокруг колоний или по конечным продуктам распада белков.

Разные виды бактерий имеют разную форму разжижения желатина: золотистый стафилококк – в виде воронки, холерный вибрион – в виде гвоздя.

Конечными продуктами распада белков могут быть индол, сероводород и аммиак. Для обнаружения этих продуктов используют индикаторные бумажки, которые помещают внутрь пробирки между стенкой пробирки и ватно-марлевой пробкой. Индикатором на индол (продукт разложения триптофана) является щавелевая кислота. Пропитанная щавелевой кислотой бумажка при наличии индола меняет белый цвет на розовый. В настоящее время тестирование культур на образование индола проводят при помощи реактива Ковача или реактива Эрлиха.

Индикатором на сероводород является ацетат свинца. При наличии сероводорода белая бумажка приобретает черный цвет за счет образования сульфита свинца Индикатором на аммиак (продукт разложения фенилаланина) является лакмусовая полоска бумаги. При наличии аммиака красная лакмусовая бумажка приобретает синий цвет.

Лиазы – это ферменты, которые катализируют отщепление от субстратов определенных химических групп с образованием двойных связей или присоединение отдельных групп (например, аминогрупп, альдегидных групп) по месту двойных связей без участия воды (декарбоксилазы, дезаминазы). В частности, выявление декарбоксилаз проводится на питательных средах с добавлением соответствующей аминокислоты (например, лизиндекарбоксилазу определяют на среде с лизином).

Изомеразы – это ферменты, производящие глубокие внутримолекулярные перестройки, то есть превращение органических соединений в их изомеры (изомеразы, трансферазы, топоизомеразы). В лабораторной практике эти ферменты не выявляют.

Лигазы (синтетазы) – это ферменты, которые катализируют синтез сложных органических веществ (сшивание, лигирование) из простых соединений с одновременным разрывом фосфатных связей (аспарагинсинтетаза, кокарбоксилазы).

бактерий в тканях макроорганизма, а также ослабляют его защитные силы. К ферментам агрессии относятся гиалуронидаза, коллагеназа, лецитиназа, ДНКаза, лейкоцидин, гемолизин, плазмокоагулаза, фибринолизин, нейраминидаза, протеаза и

Пигменты бактерий,классификация по растворимости в воде. Примеры, ихзначение.

Пигменты бактерий – это специфические фоторецепторные молекулы, вторичные метаболиты, образующиеся на свету и придающие бактериям окраску. (Наличие у бактерий пигментов обычно связано с их способностью существовать за счет энергии света. Некоторые микроорганизмы утратили способность к фотосинтезу, но сохранили пигменты. Способность образовывать пигменты детерминирована генетически и используется в качестве диагностического признака.

Различают красные пигменты (актиномицеты, дрожжи, грибы, «чудесная палочка» — Serratia marsences), желтые или оранжевые (микобактерий туберкулеза, сарцины, стафилококки), синие (синегнойная палочка — Pseudomonos aeruginosa,), фиолетовые (Chromobacterium violaceum), черные (некоторые виды грибов, дрожжей, почвенных микробов).

Различают пигменты, растворимые в воде (синегнойная бактерия, бактерии сине-зеленого молока — пиоцианин, синцианин),

в спирте (пигменты «чудесной» палочки, стафилококков и сарцин — красный, золотистый, лимонно-желтый и желтый),

не растворимые ни в воде, ни в спирте (черные пигменты дрожжей, грибов, азотобактера), выделяющиеся в окружающую среду (хромонарные), остающиеся в теле микроорганизмов (хромофорные).

Значение пигментов:

Ø защита от действия видимого света и УФ-лучей;

Ø ассимилируют углекислый газ;

Ø обезвреживают токсичные кислородные радикалы;

Ø участвуют в синтезе витаминов;

Ø обладают антибиотическим действием и свойствами биологически активных веществ;

Ø цвет пигмента используют в идентификации бактерий.

 

Определение сероводорода

Реакция на сероводород. Сероводород яв­ляется конечным продуктом расщепления аминокислот: цистина, цистеина и метионина, содержащих серу. Петлю ис­следуемой культуры микробов засевают в пробирку с мясо-пептонным бульоном или бульоном Хоттингера. Тотчас после посева в пробирку вносят пропитанную ацетатом свинца по­лоску индикаторной бумаги на определение сероводорода. В положительных случаях после инкубации при 37⁰ в течение 2-3 суток образующийся в культуре сероводород вступает в соединение с бесцветным ацетатом свинца и превращается в сульфид свинца, который придает индикаторной бумаге черно-бурое окрашивание. E.coli не образует сероводород в отличие от возбудителей брюшного тифа и паратифа В.

Окончательный учет результатов на образование индола и сероводорода проводят на 7—10‑й день после посева, так как процесс ферментативного расщепления белка и образова­ния конечных продуктов распада происходит иногда в тече­ние длительного времени.

 

7. Принципы определения каталазной и плазмокоагулазной активности стафилококков.

Ферменты бактерий. Химическая природа. Экзо- и эндоферменты, их значение в метаболизме клетки. Конститутивные и Индуцибельные ферменты. Примеры. Классы ферментов: оксидоредуктазы; трансферазы; гидролазы; лиазы; изомеразы; лигазы (синтетазы).

Все обменные процессы в бактериальной клетке идут с участием ферментов (энзимов). Ферменты выполняют функцию биокатализаторов. Они представляют собой простые или сложные белки. Принято различать экзоферменты и эндоферменты. Экзоферменты выделяются микробной клеткой во внешнюю среду. Часть экзоферментов связана с питанием бактерий, так как они расщепляют питательные вещества до такой формы, которая способна усваиваться микробной клеткой. Эндоферменты участвуют в разложении питательных веществ внутри клетки и в превращении их в составные части клетки.

Одни ферменты синтезируются бактериальной клеткой постоянно (конститутивные ферменты), другие ферменты синтезируются только при контакте с определенным субстратом (индуцибельные ферменты). В частности, конститутивными ферментами являются ферменты гликолиза – ферменты окисления глюкозы (гексокиназа, глюкозоизомераза, альдолаза и др.). Индуцибельными ферментами являются бета-галактозидаза (катализирует расщепление лактозы на глюкозу и галактозу) и бета-лактамаза (расщепляет бета-лактамные антибиотики).

Все ферменты подразделяются на шесть классов:

1. оксидоредуктазы;

2. трансферазы;

3. гидролазы;

4. лиазы;

5. изомеразы;

6. лигазы (синтетазы).

Оксидоредуктазы – это ферменты, которые катализируют окислительно- восстановительные реакции и встречаются во всех живых клетках. Их основная функция – обеспечение организма энергией в доступной для использования форме. Важнейшими представителями оксидоредуктаз являются дегидрогеназы, оксидазы, пероксидазы, гидроксилазы, оксигеназы, каталаза. При идентификации бактерий в основном используют методы выявления каталазы и цитохромоксидазы.

Каталаза разлагает пероксид водорода на воду и молекулярный кислород. Этот фермент выявляют по образованию пузырьков кислорода после смешивания микробной суспензии с 1% раствором перекиси водорода на стекле или после нанесения раствора перекиси водорода на культуру, выросшую на поверхности плотной питательной среды.

Цитохромоксидаза окисляет молекулы цитохрома С, восстанавливая кислород. Цитохромоксидазу обнаруживают смачиванием бумажки специальным реактивом (1% спиртовый раствор α-нафтола; 1% водный раствор N-диметил-β- фенилендиамина дигидрохлорида). Нанесение на бумажку капли суточной культуры бактерий приводит к появлению синего окрашивания.

Трансферазы    – ферменты, которые катализируют перенос отдельных радикалов (РО₃, Н₂, СН₃), частей молекул или целых атомных группировок от одних соединений  к другим. К трансферазам относятся ацетилтрансфераза, фосфотрансфераза, аминотрансфераза,  метилтрансфераза.   Эти                     ферменты в повседневной лабораторной практике не определяют.

Гидролазы – ферменты, которые катализируют реакции расщепления и синтеза белков, жиров и углеводов с участием воды. К этому классу ферментов относятся пептидогидролазы или протеазы - ферменты, расщепляющие белки; гидролазы гликозидов или гликозидазы, расщепляющие гликозиды (β- фруктофуранозидаза, α-глюкозидаза, β-галактозидаза); эстеразы, катализирующие расщепление сложных эфиров (липаза, фосфатаза). При идентификации бактерий в первую очередь изучают ферменты, расщепляющие углеводы и белки. Способность бактерий расщеплять углеводы, называется сахаролитической активностью, а способность расщеплять белки – протеолитической активностью. При ферментации сахаров выявляют образование кислоты (молочной, уксусной, муравьиной) или кислоты и газа (углекислого газа, водорода), а при распаде белков – образование щелочей, сероводорода, индола, аммиака.

Для выявления гликозидаз используют жидкие или полужидкие среды Гисса.

Протеазы бактерий выявляют при посеве чистой культуры на специальные питательные среды (мясо-пептонный желатин - МПЖ, молочный агар, мясо- пептонный бульон – МПБ). Результат оценивают по разжижению желатина, разложению казеина молока вокруг колоний или по конечным продуктам распада белков.

Разные виды бактерий имеют разную форму разжижения желатина: золотистый стафилококк – в виде воронки, холерный вибрион – в виде гвоздя.

Конечными продуктами распада белков могут быть индол, сероводород и аммиак. Для обнаружения этих продуктов используют индикаторные бумажки, которые помещают внутрь пробирки между стенкой пробирки и ватно-марлевой пробкой. Индикатором на индол (продукт разложения триптофана) является щавелевая кислота. Пропитанная щавелевой кислотой бумажка при наличии индола меняет белый цвет на розовый. В настоящее время тестирование культур на образование индола проводят при помощи реактива Ковача или реактива Эрлиха.

Индикатором на сероводород является ацетат свинца. При наличии сероводорода белая бумажка приобретает черный цвет за счет образования сульфита свинца Индикатором на аммиак (продукт разложения фенилаланина) является лакмусовая полоска бумаги. При наличии аммиака красная лакмусовая бумажка приобретает синий цвет.

Лиазы – это ферменты, которые катализируют отщепление от субстратов определенных химических групп с образованием двойных связей или присоединение отдельных групп (например, аминогрупп, альдегидных групп) по месту двойных связей без участия воды (декарбоксилазы, дезаминазы). В частности, выявление декарбоксилаз проводится на питательных средах с добавлением соответствующей аминокислоты (например, лизиндекарбоксилазу определяют на среде с лизином).

Изомеразы – это ферменты, производящие глубокие внутримолекулярные перестройки, то есть превращение органических соединений в их изомеры (изомеразы, трансферазы, топоизомеразы). В лабораторной практике эти ферменты не выявляют.

Лигазы (синтетазы) – это ферменты, которые катализируют синтез сложных органических веществ (сшивание, лигирование) из простых соединений с одновременным разрывом фосфатных связей (аспарагинсинтетаза, кокарбоксилазы).

бактерий в тканях макроорганизма, а также ослабляют его защитные силы. К ферментам агрессии относятся гиалуронидаза, коллагеназа, лецитиназа, ДНКаза, лейкоцидин, гемолизин, плазмокоагулаза, фибринолизин, нейраминидаза, протеаза и

Пигменты бактерий,классификация по растворимости в воде. Примеры, ихзначение.

Пигменты бактерий – это специфические фоторецепторные молекулы, вторичные метаболиты, образующиеся на свету и придающие бактериям окраску. (Наличие у бактерий пигментов обычно связано с их способностью существовать за счет энергии света. Некоторые микроорганизмы утратили способность к фотосинтезу, но сохранили пигменты. Способность образовывать пигменты детерминирована генетически и используется в качестве диагностического признака.

Различают красные пигменты (актиномицеты, дрожжи, грибы, «чудесная палочка» — Serratia marsences), желтые или оранжевые (микобактерий туберкулеза, сарцины, стафилококки), синие (синегнойная палочка — Pseudomonos aeruginosa,), фиолетовые (Chromobacterium violaceum), черные (некоторые виды грибов, дрожжей, почвенных микробов).

Различают пигменты, растворимые в воде (синегнойная бактерия, бактерии сине-зеленого молока — пиоцианин, синцианин),

в спирте (пигменты «чудесной» палочки, стафилококков и сарцин — красный, золотистый, лимонно-желтый и желтый),

не растворимые ни в воде, ни в спирте (черные пигменты дрожжей, грибов, азотобактера), выделяющиеся в окружающую среду (хромонарные), остающиеся в теле микроорганизмов (хромофорные).

Значение пигментов:

Ø защита от действия видимого света и УФ-лучей;

Ø ассимилируют углекислый газ;

Ø обезвреживают токсичные кислородные радикалы;

Ø участвуют в синтезе витаминов;

Ø обладают антибиотическим действием и свойствами биологически активных веществ;

Ø цвет пигмента используют в идентификации бактерий.

 

Практическое использование биохимической активности м/о в микробиологической промышленности и медицинской микробиологии