Й этап исследования на третий день

Идентификация выделенной чистой культуры возбудителя и определение для этой культуры чувствительности к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам — третий этап бактериологичестого метода. Идентификацию выделенной бактериальной культуры производят по тинкториальным, морфологическим, биохимическим, культуральным, токсигенным, антигенным свойствам.

Первым делом берут мазок из культуры, выросшей на скошенном агаре, исследуют морфологию бактерий и проверяют чистоту культуры выросших бактерий (метод Грама). Если под микроскопом наблюдают бактерии однотипной морфологии, размеров и тинкториальних (способность окрашиваться) свойств, делают вывод, что культура чиста. Чистая культура- бактерии одного вида, выросшие на питательной среде.

 Далее осуществляют посев выделенной чистой культуры бактерий на среды Гисса. Желательно провести посев и на другие среды для определения биохимических свойств.(см. впр. 27-28) При некоторых инфекционных заболеваниях (дифтерия) идентификацию проводят по токсигенным свойствам микробов. Метод основывается на определении токсигенной активности коринебактерий дифтерии с помощью реакции преципитации. Образование линий преципитации между колониями токсигенних штаммов и бумагой, пропитанной антитоксинной сывороткой, свидетельствует о позитивной реакции. С целью установления видовой принадлежности бактерий часто изучают их антигенное строение, т.е. проводят идентификацию по антигенными свойствами. Иногда идентификацию бактерий проводят, заражая лабораторных животных чистой культурой и наблюдая за теми изменениями, которые вызывают возбудители в организме (туберкулез, ботулизм, столбняк, сальмонеллез и т.п.). Такой метод называют идентификацией по биологическим свойствам. Как объекты чаще всего используют гвинейских свинок, белых мышей и крыс. Вышеперечисленные исследования, которые проводятся в бактериологической лаборатории, позволяют определить род или вид возбудителя.

Метод бумажных дисков базируется на выявлении зоны подавления размножения бактерий вокруг дисков, которые пропитаны антибиотиками. В случае применения метода серийных разведений химический препарат — антибиотик с жидкой питательной средой разводят в пробирках, после чего засеивают в пробирки одинаковое количество бактерий. По отсутствию или наличию роста бактерий проводят учет результатов. В результате бактериологического метода исследования для определения идентичности штаммов, полученная антибиотикограмма может служить и эпидемиологическим целям. Могут проводиться повторные исследования при выявлении бактерионосительства т. к. можно не обнаружить возбудителя в одной порции материала.

27. Питательные среды. Требования к питательным средам. (СРАЗУ СМОТРИТЕ «* ВОПРОС, ТАМ ПОЧЕМУ_ТО ПОЧТИ ОДИНАКОВО)

Тут будет много. Во-первых, потому что это важный вопрос. Ну, если ты не знаешь про питательные среды, то можно ни на что не рассчитывать. Во-вторых, Читается легко, подбирала материал нормальный. В-третьих, у меня слетели все вопросы, которые я делала и сейчас делаю экстренно, поэтому впихиваю самое-самое легкопонятное и доступное. Не обессудьте. Все сдадим! Но если кто-то более менее шарит, то просто кину максимально короткую классификацию и максимально краткий ответ на вопрос:

Классификацию питательных сред.

1. По консистенции (в зависимости от содержания агар-агара):

– жидкие (пептонная вода, сахарный бульон);

– полужидкие(0,5% МПА);

– твердые (2% МПА).

2. По составу:

– простые (МПА, пептонная вода);

– сложные (кровяной агар, сывороточный агар).

3. По назначению:

– элективные (1% пептонная вода, ЖСА);

– среды обогащения или селективные (среда Плоскирева);

– дифференциально – диагностические (среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева);

– транспортные или консервирующие (среды,содержащие глицерин).

Требования, предъявляемые к питательным средам:

1. содержание всех необходимых для размножения определенных микроорганизмов веществ в легкоусвояемой форме;

2. оптимальная влажность;

3. оптимальная вязкость;

4. оптимальная рН;

5. стерильность;

6. содержание ростовых факторов, которые играют роль католизаторов метаболических процессов;

7. среда должна быть изотоничной

Дальше для тех, кто хочет разобраться и знать, че такое питательная среда, а че такое голодный понедельник

Питательные среды являются основой микробиологической работы, и их качество нередко определяет результаты всего исследования. Среды должны создавать оптимальные (наилучшие) условия для жизнедеятельности микробов.

Требования, предъявляемые к средам

 Среды должны соответствовать следующим условиям:

1) быть питательными, т.е. содержать в легко усвояемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей. Ими являются источники органогенов и минеральных (неорганических) веществ, включая микроэлементы. Минеральные вещества не только входят в структуру клетки и активизируют ферменты, но и определяют физико-химические свойства сред (осмотическое давление, рН и др.). При культивировании ряда микроорганизмов в среды вносят факторы роста − витамины, некоторые аминокислоты, которые клетка не может синтезировать;

2) иметь оптимальную концентрацию водородных ионов − рН, так как только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества. 9 Для большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (рН 7,2−7,4). Исключение составляют холерный вибрион − его оптимум находится в щелочной зоне (рН 8,5−9,0) и возбудитель туберкулеза, нуждающийся в слабокислой реакции (рН 6,2−6,8). Чтобы во время роста микроорганизмов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не изменили рН, среды должны обладать буферностью, т.е. содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена;

3) быть изотоничными для микробной клетки, т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимальна среда, соответствующая 0,5 % раствору натрия хлорида;

4) быть стерильными, так как посторонние микробы препятствуют росту изучаемого микроба, определению его свойств и изменяют свойства среды (состав, рН и др.);

5) плотные среды должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию;

6) обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, т.е. соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом RH2. Этот потенциал показывает насыщение среды кислородом. Для одних микроорганизмов нужен высокий потенциал, для других − низкий. Например, анаэробы размножаются при RH2 не выше 5, а аэробы − при RH2 не ниже 10. Окислительно-восстановительный потенциал большинства сред удовлетворяет требованиям к нему аэробов и факультативных анаэробов;

7) быть по возможности унифицированным, т.е. содержать постоянные количества отдельных ингредиентов. Так, среды для культивирования большинства патогенных бактерий должны содержать 0,8−1,2 мл аминного азота NH2, т.е. суммарного азота аминогрупп аминокислот и низших полипептидов; 2,5−3,0 гл общего азота N; 0,5 % хлоридов в пересчете на натрия хлорид; 1 % пептона. Желательно, чтобы среды были прозрачными − удобнее следить за ростом культур, легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами.

Классификация питательных сред

Потребность в питательных веществах и свойствах среды у разных видов микроорганизмов неодинакова. Это исключает возможность создания универсальной среды. Кроме того, на выбор той или иной среды влияют цели исследования.

В настоящее время предложено огромное количество сред, в основу классификации которых положены следующие признаки.

• Исходные компоненты. По исходным компонентам различают натуральные и синтетические среды. Натуральные среды готовят из продуктов животного и растительного происхождения. В настоящее время разработаны среды, в которых ценные пищевые продукты (мясо и др.) заменены непищевыми: костной и рыбной мукой, кормовыми дрожжами, сгустками крови и др. Несмотря на то, что состав питательных сред из натуральных продуктов очень сложен и меняется в зависимости от исходного сырья, эти среды нашли широкое применение.

Синтетические среды готовят из определенных химически чистых органических и неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворенных в дважды дистиллированной воде. Важное преимущество этих сред в том, что состав их постоянен (известно, сколько и какие вещества в них входят), поэтому эти среды легко воспроизводимы.

• Консистенция (степень плотности). Среды бывают жидкие, плотные и полужидкие. Плотные и полужидкие среды готовят из жидких веществ, к которым для получения среды нужной консистенции прибавляют обычно агар-агар или желатин.

Агар-агар − полисахарид, получаемый из определенных сортов морских водорослей. Он не является для микроорганизмов питательным веществом и служит только для уплотнения среды. В воде агар плавится при 80−100 °С, застывает при 40−45 °С.

Желатин − белок животного происхождения. При 25−30 °С желатиновые среды плавятся, поэтому культуры на них обычно выращивают при комнатной температуре. Плотность этих сред при рН ниже 6,0 и выше 7,0 уменьшается, и они плохо застывают. Некоторые микроорганизмы используют желатин как питательное вещество — при их росте среда разжижается. Кроме того, в качестве плотных сред применяют свернутую сыворотку крови, свернутые яйца, картофель, среды с селикагелем.

• Состав.

Среды делят на простые и сложные. К первым относят мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), бульон и агар Хоттингера, питательный желатин и пептонную воду. Сложные среды готовят, прибавляя к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и другие вещества, необходимые для размножения того или иного микроорганизма

Техника работы с плотными питательными средами

4. Назначение:

а) основные (общеупотребительные) среды служат для культивирования большинства патогенных микробов. Это вышеупомянутые МПА, МПБ, бульон и агар Хоттингера, пептонная вода;

б) специальные среды служат для выделения и выращивания микроорганизмов, не растущих на простых средах. Например, для культивирования стрептококка к средам прибавляют сахар, для пневмо- и менингококков − сыворотку крови, для возбудителя коклюша − кровь;

в) элективные (избирательные) среды служат для выделения определенного вида микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов. Так, соли желчных кислот, подавляя рост кишечной палочки, делают среду элективной для возбудителя брюшного тифа. Среды становятся элективными при добавлении к ним определенных антибиотиков, солей, изменении рН.

Жидкие элективные среды называют средами накопления. Примером такой среды служит пептонная вода с рН 8,0. При таком рН на ней активно размножается холерный вибрион, а другие микроорганизмы не растут;

 г) дифференциально-диагностические среды позволяют отличить (дифференцировать) один вид микробов от другого по фермен- 12 тативной активности, например среды Гисса с углеводами и индикатором. При росте микроорганизмов, расщепляющих углеводы, изменяется цвет среды;

д) консервирующие среды предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала; в них предотвращается отмирание патогенных микроорганизмов и подавляется развитие сапрофитов. Пример такой среды − глицериновая смесь, используемая для сбора испражнений при исследованиях, проводимых с целью обнаружения ряда кишечных бактерий.

При посеве бактерий на питательные среды наблюдается сложный процесс роста бактериальных культур, в котором следует различать рост (увеличение размера) отдельных бактериальных клеток и их размножение, т.е. нарастание числа жизнеспособных особей. Рост отдельных бактерий можно наблюдать под микроскопом или путем микрокиносъемки в специальных камерах, процесс же размножения анализируют путем высева на плотные питательные среды с последующим подсчетом числа бактериальных колоний.

В процессе культивирования происходит не только размножение, но и отмирание бактерий. Следовательно, полное представление об интенсивности размножения клеток бактериальных культур можно получить только в том случае, если подсчитывать не только число жизнеспособных особей, но и общее количество бактерий.

Среда Эндо

Состав: МПА, лактоза, индикатор фуксин (в нейтральной среде – розовый, при сдвиге рН в кислую сторону становится малиновым). Среда разливается в чашки Петри и используется для выделения чистой культуры энтеробактерий.

Среда Гисса

Жидкая среда Гисса

Состав: МПБ, субстрат (углевод), индикатор Андреде (при сдвиге рН в кислую сторону становится красным). Для определения газообразования в пробирку со средой помещают поплавок.

 

Полужидкая среда Гисса

Состав: 0,5 % МПА, субстрат (углевод), индикатор ВР (водный голубой и розоловая кислота, в нейтральной среде цвет розовый, при сдвиге рН в кислую сторону становится синим). При газообразовании в среде появляются пузырьки газа.

Среды Ресселя

Состав: МПА, глюкоза, лактоза, манит, сахароза, индикатор бромтимоловый синий (в нейтральной среде – сине-зеленого цвета, при сдвиге рН в кислую сторону становится желтым). При газообразовании в среде появляются пузырьки газа. Состоит из 2-х пробирок со скошенной средой.