Распространение фагов в природе. Методы обнаружения и получения фагов. Практическое использование фагов.

Фаги широко распространены в природе. Это возбудители инфекционных заболеваний человека, животных, растений. Бактериофаги встречаются везде, где есть микроорганизмы, в которых они паразитируют: в молоке и молочных продуктах, овощах и фруктах, в почве, водоемах, сточных водах, выделениях людей и животных и т.д

Методы обнаружения и получения фагов: Выделение фага из объектов окружающей среды Для получения вирулентного фага готовят фильтрат, пропуская исходный материал (вода, суспензия фекалий и др.) через бактериальные фильтры. Фильтрат вместе с соответствующей бактериальной культурой засевают в бульон и инкубируют при 37 °С в течение 18 - 24 ч. После лизиса культуры оставшиеся бактериальные клетки удаляют центрифугированием или фильтрацией через бактериальный фильтр. Наличие фага в фильтрате определяют качественными и количественными методами:

Практическое использование:

1. Фагодиагностика:

– фагоиндикация

– фагоидентификация

– фаготипирование

2. Фагопрофилактика и фаготерапия (для лечения ожогов, кишечных инфекций, дисбактериозов, осткомиелита им тд)

3. Изучение вопросов наследственности, изменчивости, генная инженерия и т.д.

1.Фагодиагностика -метод индикации (обнаружения) патогенных бактерий в исследуемом материале при помощи специальных (индикаторных) фагов.

• РНТФ (реакция нарастания титра фага) – качественный метод определения фага

• Компоненты:

– исследуемый материал

– определенное количество частиц индикаторного фага

Инкубируют, фильтруют через бактериальный фильтр и в фильтрате подсчитывают количество фаговых частиц. Увеличение числа фаговых частиц свидетельствует о присутствии в материале соответствующих бактерий. Подсчет фаговых частиц в фильтрате проводят методом титрования по Грациа(количественный метод определения фага). Метод титрования Грация: 1) Делают десятикратные разведения фильтрата с бактериофагом от 10-1 до 10-7 2) В каждое разведение бактериофага добавляют: взвесь чувствительных к данному фагу бактерий; полужидкий агар (+45ºС); 3) Полученную смесь из каждой пробирки быстро выливают на поверхность агара в чашках Петри, где она застывает тонким слоем, инкубируют 4) Незараженные фагом бактерии, размножаясь, образуют сплошной газон роста на поверхности питательного агара. Каждая инфицированная фагом бактерия лизируется и освобождает потомство фага, состоящее из сотен новых фаговых частиц. Они внедряются в интактные клетки, и весь цикл повторяется. В результате лизиса клеток на сплошном бактериальном газоне появляются стерильные пятна, или негативные колонии фага.

2.Фагоидентификация- определение вида чистой культуры по её чувствительности к определённому бактериофагу. Проводится на 3-ем этапе бактериологического метода: 1)Берут 2 пробирки (“О” - опыт и “К” - контроль) с жидкой питательной средой (МПБ): в “О” вносят чистую культуру и диагностический специфический бактериофаг, в “К” вносят чистую культуру без бактериофага. 2) Если в контроле бульон помутнел, а в опыте остался прозрачным, значит чистая культура чувствительна к данному бактериофагу.

3.Фаготипирование - определение чувствительности культуры бактерий к узкоспецифическим (типовым) бактериофагам. Проводится для установления источника инфекции. 1)Идентифицированную культуру бактерий засевают на поверхность питательного агара в чашке Петри, подсушивают в термостате, затем делят на квадраты, на которые пипеткой наносят по одной капле различных типовых фагов. 2)После суточной инкубации просматривают чашку, отмечая те квадраты, в которых имеется лизис бактерий (стерильные пятна). Фаготип бактериальной культуры определяется тем типом фага, который вызывает ее лизис.

26. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний.

Бактериологический метод заключается в выделении чистой культуры возбудителя (популяции, содержащей бактерии одного вида) и идентификации этого возбудителя.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ: О ВЫДЕЛЕННОЙ КУЛЬТУРЕБАКТЕРИЙ (вид; биовар, серовар, фаготип); ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИБИОТИКАМ.

В первый день (1-й этап исследования) в стерильную посуду (пробирка, колба, флакон) забирают патологический материал. Изучают его внешний вид, консистенцию, цвет, запах и другие признаки; готовят мазок, красят и исследуют под микроскопом. Посев проводят бактериологической петлей (применяется чаще всего), с помощью шпателя методом Дригальского, ватномарлевым тампоном. Чашки закрывают, переворачивают вверх дном, подписывают специальным карандашом и ставят в термостат при оптимальной температуре (37 °С) на 18−48 ч. Цель этапа – получить изолированные колонии микроорганизмов.

Метод Дригальского: Каплю исследуемого материала вносят в первую чашку Петри и стерильным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках. С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга и будут образовываться изолированные колонии.

Посев делается, как правило, на плотные питательные среды, которые выбирают исходя из свойств предполагаемого возбудителя. При бактериологическом методе применяют по возможности среды, на которых растет только конкретный вид бактерий — элективные среды, или среды, позволяющие отличить предполагаемого возбудителя от других микроорганизмов или по-другому дифференциально-диагностические среды.

На второй день (2-й этап исследования) на поверхности плотной питательной среды микроорганизмы образуют сплошной, густой рост или изолированные колонии. На жидких питательных средах бактерии также могут расти поразному, хотя особенности проявлений роста более бедны, чем на плотных. Чашки тщательным образом рассматривают и изучают изолированные колонии, которые выросли на поверхности агара.

Культуральные свойства:

а) рост на жидких питательных средах:

– поверхностный (в виде пленки);

– диффузный (равномерное помутнение);

– придонный (в виде осадка)

б) рост на плотных питательных средах:

1. Величина (диаметр); большие (4−6 мм и больше), средние (2−4 мм), мелкие (1−2 мм), карликовые или точечные (меньше 1 мм).

2. Форма колоний (правильно круглая, неправильная (амебопод

обная))

 3. Прозрачность (прозрачными, пропускающими свет, и мутнымb)

 4. Рельеф (плоские, выпуклые, куполообразные, каплеподобные, конусообразные, плосковыпуклые, плоские и тд)

5. Поверхность колоний (Может быть матовой или блестящей, с глянцем, сухой или влажной, гладкой и блестящей или шершавой)

6. Цвет. Подавляющее большинство микроорганизмов образуют бесцветные колонии или мутно-молочного цвета. Однако некоторые из них формируют цветные колонии(из-за фермента,который синтезирует бактерия(золотистый)

7. Консистенция(пастообразная, вязкая или слизистая, сухая, хрупкая и т.п.)

Из подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают их методом Грамма для изучения морфологических и тинкториальних свойств возбудителей, исследуют подвижность бактерий в «висячей» или «раздавленой» капле. Эти признаки имеют чрезвычайно большое диагностическое значение при характеристике отдельных видов микроорганизмов. Остатки исследуемых колоний осторожно снимают с поверхности среды и засевают на скошенный агар или в секторы чашки Петри с питательной средой для получения чистой культуры. Пробирки или чашки с посевами помещают в термостат.