Лекция 8. Промышленные процессы с использованием иммобилизованных ферментов и клеток.

Основы биотехнологии ферментативного гидролиза целлюлозы.

В результате были выработаны принципы создания противоточных ферментных реакторов для непрерывного гидролиза целлюлозы. Особенности действия подобных реакторов следующие:

1. Рабочая зона колонного реактора плотно набивается целлюлозой, этим достигаются ее более высокие концентрации (до 40-60%) и объемная скорость гидролиза, а отсюда и больший выход продукта реакции – глюкозы, чем в реакторах другого типа – например, с перемешиванием.

2. Целлюлазы удерживаются на целлюлозе в реакторе за счет адсорбции по принципу аффинной хроматографии. Это позволяет обойтись без специальных мембран, удерживающих ферменты в реакторе, что удешевляет процесс.

3. Можно использовать культуральные жидкости с достаточно низким содержанием целлюлозы, так как эти ферменты концентрируются в таком реакторе за счет адсорбции.

4. Протеазы и другие ферменты, инактивирующие целлюлазы, немедленно выводятся из реактора еще до начала гидролиза целлюлозы, поскольку они, как правило, адсорбируются на целлюлозе значительно хуже целлюлаз.

5. Процесс ферментативного гидролиза идет непрерывно за счет постоянной подпитки свежей целлюлозой и многократного употребления целлюлаз в ходе реакции путем регенерации ферментов.

Адсорбция целлюлаз на целлюлозосодержащем сырье для ферментов из нескольких микробных источников оказалась настолько прочна, что позволила применять противоточный реактор колонного типа для масштабирования процесса. При этом максимальная концентрация глюкозы на выходе из реактора составляла 12-15%, но объемная продуктивность была довольно низкой в результате ингибирования продуктами гидролиза (глюкозой и целлобиозой) и не превышала 1,0 г/л××ч. Более высокая продуктивность, до 3 г/л×ч, наблюдалась при концентрации 2-5% глюкозы в сиропе. Если повысить содержание аморфной целлюлозы в колонном реакторе до 40%, то его производительность может достичь 18-20 г/л×ч. Использование термостабильных целлюлаз ускоряет процесс при более высокой температуре (60-70⁰С) и позволяет перейти к условиям гидролиза с меньшей вероятностью инфицирования посторонней микрофлорой. Однако продуктивность гидролиза даже на уровне 5 г/л×ч. в технологических условиях означает, что промышленный реактор объемом 200 куб.м. будет производить 24 т сахара в сутки.

Контрольные вопросы

1. Перспективы и особенности биотехнологии производства L-аминокислот.

2. Технология производства органических кислот.

3. Назовите особенности биотехнологии ферментативного гидролиза целлюлозы.

Литература

1. Биотехнология: Учебное пособие для вузов в 8 книгах Под ред. Егорова Н. С., Самуилова В. М. – М: Высшая школа, 1987. С. 1 – 1194.

 

Производство дрожжей.

Актуальная проблема, стоящая перед отраслевой наукой и дрожжевой промышленностью, - создание высокорентабельных экологически чистых технологий хлебопекарных дрожжей и дрожжевых препаратов. Решение этой проблемы возможно в двух направлениях:

1) разработка принципиально новых технологий утилизации сточных вод дрожжевого производства, например при получении биодобавок в строительные смеси, бетоны и пенобетоны;

2) замена традиционного углеводсодержащего сырья - мелассы на отходы или полупродукты перерабатывающих отраслей, содержащие крахмал или лактозу, и обеспечивающие замкнутый технологический цикл.

Низкий технический уровень российских дрожжевых заводов определяет и низкие показатели эффективности их работы. Выход дрожжей из мелассы в среднем по отрасли составляет 70%, следовательно 30% ценного углеводсодержащего сырья - мелассы безвозвратно теряется со сточными водами, создавая при этом сложную экологическую обстановку вокруг дрожжевых заводов. По данным на 1990 г. потребление дрожжей на душу населения в России составляло 1,43 кг в год. В Западной Европе каждый среднестатистический человек потребляет 1 кг дрожжей в год. Почти 15% всех дрожжей, выпускаемых в Европе (без учета Турции), производится на российских дрожжевых заводах.

Контрольные вопросы

1. Особенности получения соков с использованием ферментов.

2.. Проблемы дрожжевых заводов.

3. Какие вы знаете бюиотехнологии повышения питательности зерна.

4. Какие факторы ограничивают производство спирта заданной крепости.

Литература

1. Биотехнология: Учебное пособие для вузов в 8 книгах. Под ред. Егорова Н. С., Самуилова В. М. – М: Высшая школа, 1987. С. 1 – 1194.

2. Основы сельскохозяйственной биотехнологии М., Колос, 1999 г. С. 1 – 380.

 

11. Новые подходы в технологии производства пищевого и кормового белка

Вопросы. 1. Принципиальная технологическая схема получения кормовой биомассы. Производство кормовой биомассы на углеродном сырье. 2. Технология получения микробных липидов. 3. Получение кормовой биомассы из различного углеводородного сырья. 4. Получение кормовых липидов.

Получение микробного белка – самая крупнотоннажная отрасль биотехнологии. Микроорганизмы обладают высокой скоростью накопления биомассы, которая в 500 – 5000 раз выше, чем у растений или животных; микробные клетки способны накапливать очень большое количество белка (дрожжи – до 60%, бактерии – до 75% по массе); в микробиологическом производстве за счет высокой специфичности микроорганизмов отсутствует многостадийность; сам процесс биосинтеза протекает в мягких условиях при температуре 30 – 45 ⁰С, рН 3–6 и давление ~ 0,1 Мпа, менее трудоемок по сравнению с получением сельскохозяйственной продукции и органическим синтезом белков.

Классификация ферментов

По механизму действия ферменты делятся на шесть классов:

1) оксидоредуктазы – катализируют окислительно–восстановительные реакции;

2) трансферазы – реакции переноса химических групп;

3) гидролазы – реакции гидролиза (ферменты, катализирующие реакции расщепления внутримолекулярных связей, протекающие с присоединением воды в точке расщепления);

4) лиазы – присоединение групп к двойным связям или их отщепление (ферменты, удаляющие радикалы негидролитическим путем с образованием двойных связей);

5) изомеразы – реакции изомеризации (ферменты, катализирующие взаимные превращения изомеров);

6) лигазы (синтетазы) – реакции конденсации двух молекул, сопряженные с расщеплением фосфатной связи в молекуле АТФ, сшивание участков хромосом.

Добавка незначительного количества фермента (10 ^–7–10 ^{– 9} моль) ускоряет реакцию более чем в 10 раз. Каждый фермент имеет свой температурный оптимум и оптимум рН. При резком изменении рН и температуре 40–50 ⁰С ферменты денатурируют (изменение конформации, раскручивание). Имеют место сложности в очистке ферментов.

На активность ферментов, а следовательно и на скорость реакции ферментативного катализа оказывают влияние: концентрация и доступность субстрата; концентрация фермента; температура реакции; рН реакции; продолжительность процесса; наличие ингибиторов или активаторов.

За единицу активности любого фермента принято то его количество, которое катализирует превращение одного микромоля субстрата в 1 минуту при t = 30⁰С по начальной скорости реакции, когда концентрация субстрата достаточна для насыщения фермента. Количество фермента измеряют в мл, г, кг, т.

Промышленные ферментные препараты. Использование микробных ферментов в некоторых отраслях промышленности началось более 70 лет назад. Большую часть составляют гидролазы (реакции гидролиза), так как именно они являются основными в промышленной биотехнологии. От общего количества потребляемых ферментов 99% выпуска приходится на 16 препаратов.

Рассмотрим подробнее некоторые группы ферментов.

К амилолитическим ферментам относятся α-амилаза, β-амилаза, глюкоамилаза. Их действие проявляется при гидролизе крахмала и глюкогена. Крахмал при гидролизе сначала расщепляется на более простые полисахариды – декстрины, а затем - до глюкозы.

α-амилаза гидролизует любые α-1,4-глюкановые связи (амилаза, амилопектин, гликоген); β-амилаза - фермент концевого действия, последовательно отщепляет остатки дисахарида мальтозы от концов цепей. Глюкоамилаза гидролизует крахмал с образованием глюкозы и небольшого количества декстринов. Эти ферменты применяются в спиртовой промышленности, хлебопечении.

Протеолитические ферменты относятся к гидролазам, образуя группу пептидгидролаз. Их действие заключается в ускорении гидролиза пептидных связей в белках и пептидах. Важная их особенность - выборочный, селективный характер действия на пептидные связи в белковой молекуле. Например, пепсин действует только на связь с ароматическими аминокислотами, трипсин - только на связь между аргинином и лизином. Из них рН 1,5-3,7 имеют кислые протеазы; рН 6,5-7,5 - протеазы; рН> 8,0 - щелочные протеазы.

Применение протеаз широкое: мясная промышленность для умягчения мяса, кожевенная промышленность - при обезволошивании (удаление волосяного покрова) и мягчении шкур; кинопроизводство - для растворения желатинового слоя на пленках при их регенерации; парфюмерия – при создании добавок в зубную пасту, кремы, лосьоны, промышленность синтетических моющих средств – при применении моющих добавок для удаления загрязнений белковой природы; медицина – при лечении воспалительных процессов, ожогов, тромбозов.

Пектолитические ферменты объединены в одну группу по внешнему проявлению своего действия – уменьшению молекулярной массы и снижению вязкости пектиновых веществ (пектин – пектиновые кислоты и протопектин) представителей полисахаридов. Они содержатся во фруктах, корнеплодах, стеблях (лен). Пектиновые вещества имеют молекулярную массу от 20000 до 200000. Все пектиназы делятся на два вида – гидролазы и трансэлиминазы. Первые отщепляют метильные остатки (пектинэстеразы) или разрывают α–1.4–гликозидные связи (полигалактуроназы). Вторые ускоряют негидролитическое расщепление пектиновых веществ с образованием двойных связей. Применение в текстильной промышленности – вымачивание льна перед его переработкой, в виноделии – осветление вин, уничтожение мутности, в консервировании – при приготовлении фруктовых соков.

Целлюлолитические ферменты очень специфичны, их действие проявляется лишь в деполимеризации молекул целлюлозы, обычно они действуют в виде комплекса, который в целом доводит гидролиз целлюлозы до глюкозы. Использование их очень перспективно в гидролизной промышленности – это получение глюкозы из целлюлозы; в медицинской – выделение лекарственных веществ (стероидов) из растений; в пищевой – улучшение качества растительных масел; в сельском хозяйстве – как добавки в комбикорма для жвачных животных. В мире производится около 530 т протеаз, 350 т глюкоамилазы, 350 т α–амилазы, 70 т глюкозоизомеразы.

 

Лекция 14. Иммобилизованные ферменты.

Вопросы. 1. Процессы, в которых используются иммобилизованные ферменты и клетки. 2. Носители для иммобилизации ферментов. 3. Биоконверсия растительного сырья. 3. Методы физической и химической иммобилизации ферментов. Иммобилизации путем включения в полимерную структуру инкапсулирования и поперечных сшивок.

Факторы, влияющие на биосинтез ферментов. Существует мнение, что из клеток микроорганизмов можно выделить любые из известных ферментов. Большинство микроорганизмов способно расти на относительно простых и дешевых питательных средах. Преодоление трудностей, связанных с их производством и использованием, связано с получением иммобилизованных ферментов.

Иммобилизация ферментов – это перевод их в нерастворимое состояние с сохранением (частичным или полным) каталитической активности.

Для получения иммобилизованных ферментов обычно применяют следующие методы:

1. Ковалентные присоединение молекул ферментов к водонерастворимому носителю, в качестве которого используют как органические (природные и синтетические) полимеры, так и неорганические материалы. К первым относятся целлюлоза, хитин, агароза, декстрины, бумага, ткани, полистирол, ионообменные смолы и т. д., ко вторым – пористое стекло, силикагели, силохромы, керамика, металлы и т. д.

2. Захват фермента в сетку геля или полимера.

3. Ковалентная сшивка молекул фермента друг с другом или с инертными белками (при помощи би – или полифункционального реагента).

4. Адсорбция фермента на водонерастворимых носителях (часто на ионитах).

5. Микрокапсулирование (захват раствора фермента в полупроницаемые капсулы размером 5-300 мкМ).

В результате иммобилизации ферменты приобретают преимущества гетерогенных катализаторов. Их можно удалять из реакционной смеси и отделять от субстратов и продуктов ферментативной реакции) простой фильтрацией.

Иммобилизованные ферменты более устойчивы к внешним воздействиям, чем растворимые ферменты.

Принцип иммобилизации был применен не только к ферментам, но и к их субстратам – веществам, имеющим избирательное средство к ферментам. Это позволило создать метод выделения и очистки ферментов, основанный на хроматографии по сродству. Облегчилось выделение чистых ферментов.

В последнее время применяют иммобилизованные клетки микроорганизмов, содержащих естественный набор ферментов. Отпадают стадии выделения, очистки и иммобилизации ферментов. Ферменты в микроорганизме находятся в наиболее естественном окружении, что положительно сказывается на их термостабильности и операционной стабильности (продолжительности работы в условиях опыта). Ферменты в составе клеток микроорганизмов долго сохраняют каталитические свойства. Они также являются гетерогенными биокатализаторами со всеми преимуществами их использования в технологических целях.

Иммобилизация клеток обычно проводится их адсорбцией на водонерастворимых носителях (часто на ионообменных смолах), ковалентной сшивкой с помощью бифункциональных реагентов (например, глутарового альдегида) или захвата их в полимер, как правило, с последующим формованием в виде частиц определенного размера и конфигурации.

Иммобилизация целых клеток микроорганизмов предотвращает их размножение и обычно увеличивает сохранность и срок работы в качестве катализатора по сравнению с необработанными клетками.

Для интенсификации процесса роста и синтеза ферментов часто добавляют всевозможные вытяжки или экстракты, содержащие дополнительные факторы роста. К ним относятся прежде всего аминокислоты. Они легко проникают внутрь клетки и специфически влияют на образование фермента. Механизм их действия заключается в компенсации недостающих свободных внутриклеточных аминокислот, необходимых для синтеза фермента. Факторами роста являются также пуриновые основания и их производные, РНК и продукты ее гидролиза. Существенное влияние оказывают минеральные соли Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, Cu²⁺ и некоторых других металлов. Ионы Са повышают устойчивость α–амилазы, ионы Fe и Mg активизируют и стабилизируют протеолитические ферменты; Fe²⁺ и Cu²⁺ участвуют в реакциях, связанных с утилизацией и превращением энергии.

Понятие о биоконверсии

Биоконверсия заключается в превращении метаболитов в структурно-родственные соединения под действием микробных клеток. Тем самым микроорганизмы могут влиять только на отдельные стадии сложных процессов химического синтеза, уменьшать количество стадий.

Один из древнейших видов биоконверсии - превращение этилового спирта в уксусную кислоту, которое происходит при получении уксуса. Использование этого процесса, осуществляемого Gluconobacter suboxidans, можно проследить вплоть до Древнего Вавилона (5000 лет до н. э.).

Биоконверсии чрезвычайно специфичны, поскольку они имеют дело с одним типом реакции и с соединением определенной структуры (стереоспецифичность). В ходе биоконверсий происходит превращение изопропанола в ацетон, глицерина в дигидроксиацетон, глюкозы в глюконовую кислоту и затем в 2–кетоглюконовую или 5–кетоглюконовую кислоты и сорбита в L–сорбозу. Биоконверсия сорбита в сорбозу – единственная биологическая реакция в химическом производстве аскорбиновой кислоты (витамина С).

Применение методов, основанных на биоконверсии, наиболее полно иллюстрирует история синтеза стероидных гормонов. В 1930-х г.г. Кендалл и Райхштейн выделили из надпочечников кортизон. Десятилетием позже Кенч установил, что кортизон эффективен при лечении ревматоидного артрита. Химический синтез кортизона состоит из 37 стадий и 1 г вещества, произведенного таким способом, стоит 200 долл. Одна из ключевых стадий синтеза состоит во введении атома кислорода в положение 11 L стероидного ядра; эта стадия необходима для создания физиологически активной молекулы. В 1952 г. Петерсон и Мюррей обнаружили, что штамм грибов Rhizopus arrhizus способен гидроксилировать прогестерон и тем самым вводить атом кислорода в положение 11 L. При помощи штамма грибов Rhizopus arrhizus синтез кортизона сократился до 11 стадий вместо 37 при химическом синтезе, а стоимость гормона упала с 200 до 6 долл. за 1 г. Другие преимущества микробной конверсии заключались в том, что брожение происходило при 37⁰С в водной среде и при атмосферном давлении, тогда как химический синтез кортизона требовал экстремальных температур и давления. Сегодня любой атом углерода стероидного ядра можно гидроксилировать при помощи определенных микроорганизмов. Микроорганизмы находят также применение при производстве сырья для получения стероидов. Таким сырьем являются стерины, их основными источниками служат диосгенин из корней ямса и стигмастерин и ситостерин, экстрагируемые из жмыха соевых бобов.

Иногда для биоконверсии требуются смешанные культуры или последовательное добавление микробных штаммов или видов, каждый из которых осуществляет специфическую стадию биоконверсии. Использование иммобилизованных клеток, более стабильных, чем ферменты или клеточные культуры, дает возможность повысить эффективность биоконверсии и уменьшить ее стоимость. Это поможет в решении проблем, связанных с нерастворимостью субстратов, таких как стероиды.

Лекция 8. Промышленные процессы с использованием иммобилизованных ферментов и клеток.

Вопросы. 1. Получение глюкозо-фруктозных сиропов. Получение L - аминокислот, L - яблочной кислоты. 2. Целлюлолитические микроорганизмы и ферменты. 3. Использование ферментов для получения сахаров из целлюлозы.

К настоящему времени промышленные процессы нашли крупномасштабное промышленное применение семь процессов с использованием иммобилизованных ферментов или клеток:

1. Производство глюкозо–фруктозных сиропов и фруктозы из глюкозы.

2. Получение оптически активных L–аминокислот из их рацемических смесей.

3. Синтез L–аспарагиновой кислоты из фумаровой кислоты, путем присоединения NH₃     

 HOOC – CH = CH – COOH + NH  ₃ = HOOC + CH ₂ – CH – COOH

                                                                                               NH₂

4. Синтез L – яблочной кислоты из фумаровой кислоты.

5. Производство диетического безлактозного молока.

6. Получение сахаров из молочной сыворотки.

7. Получение 6–аминопенициллиновой кислоты (пенициллинового ядра) из обычного пенициллина (пенициллина G) для последующего производства полусинтетических антибиотиков пенициллинового ряда.

Некоторые процессы отрабатываются на лабораторных установках. К ним относится получение:1) глюкозы из частичных гидролизатов крахмала; 2) инвертного сахара из сахарозы; 3) глюкозы из целлюлозы; 4) белковых гидролизатов.

Получение глюкозо–фруктозных сиропов. Фруктоза, или иначе фруктовый, плодовый или медовый сахар широко распространена в природе. Особенно богаты ей яблоки и помидоры, а также пчелиный мед, который почти наполовину состоит из фруктозы. По сравнению с обычным пищевым сахаром (в состав которого фруктоза также входит, но в виде химического соединения с менее сладкой глюкозой) фруктоза обладает более приятным вкусом. Она на 60-70% слаще сахара и потреблять ее можно меньше, а значит, меньше будет и калорийность продукта. В 1973 г. американской компанией «Клинтон Корн» был внедрен в промышленность процесс превращения глюкозы во фруктозу под действием иммобилизованного фермента глюкозоизомеразы. Этот процесс стал самым крупным в мире по сравнению с другими, в которых используются иммобилизованные ферменты.

Сахароза или тростниковый сахар, - дисахарид, состоящий из глюкозы и фруктозы. Сахарозу синтезируют многие растения, у высших же животных она отсутсвует. В отличие от мальтозы и лактозы у сахарозы нет свободного аномерного атома углерода, поскольку оба аномерных атома моносахаридных остатков связаны друг с другом; поэтому сахароза не является восстанавливающим сахаром. В Животные не могут усваивать сахарозу как таковую, однако она становится доступной для усвоения после воздействия фермента сахаразы (другое его название - инвертаза), локализованного в клетках, выстилающих тонкий кишечник. Этот фермент катализирует расщепление сахарозы на D-глюкозу и D-фруктозу, которые легко проникают в кровоток.

Благодаря доступности в США больших количеств D-глюкозы, получаемой путем гидролиза кукурузного крахмала, в последнее время была предложена новая промышленная технология, позволяющая получать продукт, обладающий более сладким вкусом, чем глюкоза. По этой технологии крахмал сначала гидролизуют с образованием кукурузного сиропа - концентрированного нейтрального раствора D-глюкозы; далее полученный раствор пропускают через большую колонку, заполненную инертным носителем, к которому ковалентно пришит выделенный из растений фермент глюкоизомераза. Этот иммобилизованный на инертном носителе фермент катализирует обратимую реакцию: D-глюкоза «D-фруктоза. В результате этой реакции кукурузный сироп превращается в эквимолярную смесь D-глюкозы и D-фруктозы. Сейчас он все шире используется в пищевой промышленности, при производстве безалкогольных напитков и мороженого.

Основы технологического процесса. Фермент глюкозоизомераза катализирует превращение глюкозы, получаемой при гидролизе крахмала (кукурузного или реже картофельного) в смесь глюкозы и фруктозы. Образующийся глюкозо-фруктозный сироп содержит 42–43% фруктозы, около 51% глюкозы и не более 6% ди– или олигосахаридов, по сладости соответствует обычному сахару или инвертному сахару, получаемому кислотными (или ферментативным) гидролизом сахарозы.

Для некоторых пищевых производств (например, безалкогольных напитков типа кока–колы) употребляют глюкозо-фруктозные сиропы с содержанием фруктозы 55–90%. Их изготавливают из обычных (42%-ных по фруктозе) сиропов с использованием разделительных процессов типа жидкостной хроматографии.

Глюкозо–фруктозная смесь поступает на рынок в виде сиропов. Применяется при производстве тонизирующих и ацидофильных напитков, мороженного, кондитерских изделий, хлеба, консервированных фруктов и т. д.

Наиболее распространенный технологический вариант – реакторы в виде колонн с направлением потока сверху вниз. Высота колонн достигает 5 м. Рекомендуется использовать более чистое исходное сырье (глюкозные сиропы). При употреблении в качестве исходного сырья кристаллической глюкозы производительность реактора достигает 4000 кг (в пересчете на сухую фруктозу) на 1 кг иммобилизованного фермента за 2400 часов работы. Время полуинактивации катализатора при этом равно 50 суток. В целом, производительность промышленных реакторов варьирует от 1 до 9 т глюкозо–фруктозного сиропа на 1 кг иммобилизованной глюкозоизомеразы.

Проточные реакторы идеального вытеснения (колонного типа) с иммобилизованной глюкозоизомеразой обычно характеризуются более высокой эффективностью, чем реакторы перемешивания. Расход фермента в них в 1,4–4,0 раза ниже, чем в реакторах перемешивания, время контакта с субстратом составляет 2–4 часа, в то время как в реакторах перемешивания 20–60 часов. Это приводит к меньшему образованию побочных продуктов в реакторах колонного типа.

Важен температурный контроль в ходе процесса изомеризации. Если температуру увеличивать ступенчато (по 2⁰) от 60 до 70⁰С в течение 14 суток, то продуктивность процесса возрастает на 42% по сравнению с изотермическим проведением процесса при 60⁰С в течение тех же 14 суток.

Производство глюкозо–фруктовых сиропов из кукурузного крахмала с помощью иммобилизованной глюкозоизомеразы в 1,5 раза более экономично, чем получение сахара из сахарной свеклы по обычной технологии.

Для промышленного производства глюкозо–фруктозных сиропов с помощью иммобилизованной глюкозоизомеразы рекомендуют производительность 30-100 или 400 т в сутки в пересчете на сухое вещество.

Контрольные вопросы

1. Какие вы знаете промышленные производства, работающие с использованием иммобилизованных ферментов.

2. Получение глюкозо-фруктозных сиропов.

3. Какие необходимы ферменты для получения сахаров из целлюлозы, особенности технологического процесса.

Литература

1. Биотехнология: Учебное пособие для вузов в 8 книгах. Под ред. Егорова Н. С., Самуилова В. М. – М: Высшая школа, 1987. С. 1 – 1194.

2. Грачева И. М., Иванова Л. А., Кантере В. М. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и биоэнергия. М., Колос, 1992. С. 1 – 383

3. Основы сельскохозяйственной биотехнологии М., Колос, 1999 г. С. 1 – 380.