Получение биогаза возможно двумя способами

1.   В метантенках. Значительное количество метана получают из жидких растворов в метантенках при очистке сточных вод.

2.   При жидкофазном метановом брожении, которое происходит с частичным содержанием твердых органических веществ в водонепроницаемых цилиндрических цистернах (дайджестерах). Эти цистерны конструируют из кирпича, бетона или стали с боковым отверстием для подачи субстрата. Над цистерной находится стальной или нейлоновый купол для сбора газа. Нависая над бродящей смесью, купол препятствует проникновению внутрь воздуха. В газовом куполе имеется трубка для отвода биогаза.

В тех случаях, когда используют жидкий навоз, соотношение между твердыми компонентами и водой должно составлять 1:1 (100 кг отходов на 100 кг воды). Общая концентрация твердых веществ составляет по весу 8-11%. Смесь сбраживаемых материалов засевают ацетогенными и метаногенными бактериями. Оптимальное значение рН – 6-8. Против закисления используется жженая или гашеная известь. Максимальная температура в зависимости от вида бактерий составляет 30-40 или 50-60⁰С. Обычно дайджестеры загружают в землю. Для оптимальной переработки соотношение С/ N по весу должно быть порядка 30:1. Избыток азота в связи с накоплением аммиака подавляет рост бактерий. C / N навоза можно изменить добавлением соломы, жома. Желательно перемешивать суспензию сбраживаемых веществ. Твердый материал необходимо раздробить.

Длительность переработки навоза крупного рогатого скота составляет 2-4 недели, свинарников – около 10 дней. Двухнедельная переработка при 35⁰С способствует гибели патогенных бактерий, вирусов, паразитических червей. Для получения биогаза можно использовать отходы растениеводства (солома, ботва).

Традиционно считалось, что процесс метаногенеза может протекать только в жидкой фазе. В последние 10-15 лет разработан твердофазный способ метаногенеза, осуществляемый при влажности 30-40%. Основные требования – процесс должен протекать в анаэробных условиях. Сырьем для твердофазного производства биогаза чаще служат твердые органические отходы городского мусора. В вертикально размещенный реактор сверху загружают твердые органические вещества растительного происхождения (размер частиц 1-2 мм.).

В верхней части реактора протекают интенсивные окислительные процессы за счет развития аэробных микроорганизмов. По мере поглощения ими кислорода создаются анаэробные условия с одновременным повышением температуры бродящей массы. В процессе окисления частично разрушается органическое вещество, переводя его в форму доступную для переработки метаногенными бактериями. В нижней части реактора идет анаэробное разложение с образованием биогаза и шлама, который идет на

Производство углеводородов с помощью водорослей. С 1978 г. начались поиски заменителей нефти, получаемых с помощью растений. Содержание углеводородов в растениях, как правило, не превышало 1%. У одноклеточной водоросли Bothryococcus braumii содержание углеводородов составило 15-75% от массы сухого вещества. Эта водоросль обитает в пресной и солоноватой воде умеренной и тропической зон, встречается в двух разновидностях: красной и зеленой. Зеленая водоросль содержит линейные углеводороды с нечетным (25-31), а красная – с четным (34-38) числом атомов углерода. Углеводороды накапливаются в клеточной стенке. Их синтез связан с метаболической активностью водоросли в фазе роста. Выделяют углеводороды центрифугированием, не разрушая клеток. Удвоение биомассы водорослей – за 2-7 дней. Углеводороды составляют 35% массы сухого вещества. Выход углеводородов 0,09 г/л культуральной среды в сутки или 60 т/га в год. Используются как источник энергии или как сырье для нефтехимической промышленности.

Фотопроизводство водорода. В начале 1960 г. было установлено, что хлоропласты растений (в частности, выделенные из шпината) в присутствии искусственного донора электронов и бактериального экстракта, содержащего фермент гидрогеназу, способны продуцировать водород. Это явление основано на процессе фотолиза воды.

Получение биогумуса. Биогумус или вермикомпост получают с помощью дождевых червей, которые относятся к типу кольчатых червей, питаются разлагающимися растительными остатками. Относятся к гумусообразователям. В большинстве стран с целью получения биогумуса культивируют красного калифорнийского червя (Eizenia foetida Andrei) (навозный червь) с длиной тела более 10 см и массой тела около 700 мг.

В качестве сырья используются навоз, солома. Бункеры загружают питательным сырьем и запускают туда дождевых червей (20-30 экз. на 1 м²). По мере развития червей добавляют сырье. Забор биогумуса производят 1 раз в год, когда высота его слоя достигнет ~ 70 см (весной). Для отделения гумуса прекращается подача питательной массы, понижается влажность. Через 20 дней сверху тонким слоем насыпают сырье и увлажняют. Черви переползают в него за один день, их переносят и убирают биогумус. Возможно получить 200-300 кг биогумуса на м² в год. Биогумус проветривают 4 дня, просеивают на грохоте, доводят влажность до 45-50%, фасуют и отправляют потребителям как удобрение. Один человек, работая вручную, способен получить около 300 тонн биогумуса в год.

Добавление микробиологических добавок к субстрату, в котором развиваются черви, позволяет в несколько раз увеличить прирост их массы. Работы по улучшению качества почв с помощью дождевых червей начались в 50-е годы. Биогумус оказывается более низкого качества (0,12 дол/кг), если черви перерабатывают городской органический мусор. Основная проблема производства – содержание в биогумусе патогенов. При внесении биогумуса в почву поражаемость огурцов и томатов корневыми гнилями сокращается на 48-52%, применение 20% экстракта биогумуса снижает развитие мучнистой росы и аскохитоза на 20-26%.

Контрольные вопросы

1. Происхождение и состав природного газа и биогаза.

2. Производство биогаза из отходов переработки растениеводства и животноводства.

3. Производство источников энеогии и водорода. Химизм процесса и технология.

4. Продуценты биогумуса, субстрат, технология производства и свойства готового продукта.

Литература

1. Биотехнология: Учебное пособие для вузов в 8 книгах. Под ред. Егорова Н. С., Самуилова В. М. – М: Высшая школа, 1987. С. 1 – 1194.

2. Грачева И. М., Иванова Л. А., Кантере В. М. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и биоэнергия. М., Колос, 1992. С. 1 – 383

3. Основы сельскохозяйственной биотехнологии М., Колос, 1999 г. С. 1 – 380.

  Лекция 13. Некоторые вопросы инженерной энзимологии. Основные понятия о биологически активных веществах – ферментах

Вопросы. 1. Общие сведения о ферментах. Механизм действия ферментов. Принципы классификации ферментов. 2. Биологически активные вещества липидной природы. Применение биологически активных веществ в сельском хозяйстве и пищевой промышленности.

Ферменты (энзимы) – катализаторы белковой природы, образующиеся и функционирующие во всех живых организмах. Ферменты не изменяются и не расходуются в процессе реакции, ускоряют только те реакции, которые могут протекать и без них. Скорость протекания реакции при участии ферментов на несколько порядков выше, чем под влиянием химических катализаторов. Для ферментативных реакций характерен почти 100% выход продуктов. Ферменты обладают узкой специфичностью, действуют только на те же вещества, превращение которых они катализируют. В настоящее время в природе обнаружено свыше 3 тысяч ферментов.

Большинство биотехнологий основано на использовании биокатализаторов, потребность в которых постоянно возрастает. Единственным неограниченным источником ферментов являются микроорганизмы, из которых можно выделить любые из известных в настоящее время ферментов. Исключение составляет папаин (размягчитель мяса), который получают из плодов папайи. Продуктивность штаммов микроорганизмов, производящих ферменты, можно увеличить с помощью мутагенных факторов в 2-5 раз. Пересадкой плазмид получают количество ферментов, достигающее 50% массы продуцируемого белка.

Синтезируемые микроорганизмами ферменты подразделяются на внеклеточные и внутриклеточные. К внеклеточным ферментам относятся амилаза, целлюлаза, лактаза, липаза, пектиназа, протеаза, к внутриклеточным – аспарагиназа, каталаза, инвертаза.

Внеклеточные ферменты получают из культуральной жидкости, предварительно отделанной от микроорганизмов. Для выделения внутриклеточных ферментов разрушают клеточные оболочки с помощью механических, физических, химических (действие кислот, растворителей), ферментативных и биологических методов.

Метод разделения ферментов основан на неодинаковой растворимости белков. Осаждение ферментативных белков без потери их каталитической активности проводят солями неорганических кислот (сульфата аммония – (NH ₄) ₂SO₄), органическими растворителями (этанолом, ацетоном и др.), с помощью хроматографии (адсорбционной, гидрофобной), на гелях агарозы, полиакраламида и др., c применением гельфильтрации, центрифугирования, электрофореза и др.

Ферменты применяются в пищевой, фармацевтической, текстильной, кожевенной и др. отраслях промышленности, в медицине, сельском хозяйстве, химическом синтезе.

Более широкое технологическое применение ферментов до последнего времени сдерживалось рядом причин, из которых важнейшими являются:

1) трудоемкость отделения ферментов от исходных реагентов и продуктов реакции;

2) неустойчивость ферментов при хранении, различных воздействиях (тепловых);

3) трудоемкость очистки ферментов и получения их в активном виде.

Классификация ферментов

По механизму действия ферменты делятся на шесть классов:

1) оксидоредуктазы – катализируют окислительно–восстановительные реакции;

2) трансферазы – реакции переноса химических групп;

3) гидролазы – реакции гидролиза (ферменты, катализирующие реакции расщепления внутримолекулярных связей, протекающие с присоединением воды в точке расщепления);

4) лиазы – присоединение групп к двойным связям или их отщепление (ферменты, удаляющие радикалы негидролитическим путем с образованием двойных связей);

5) изомеразы – реакции изомеризации (ферменты, катализирующие взаимные превращения изомеров);

6) лигазы (синтетазы) – реакции конденсации двух молекул, сопряженные с расщеплением фосфатной связи в молекуле АТФ, сшивание участков хромосом.

Добавка незначительного количества фермента (10 ^–7–10 ^{– 9} моль) ускоряет реакцию более чем в 10 раз. Каждый фермент имеет свой температурный оптимум и оптимум рН. При резком изменении рН и температуре 40–50 ⁰С ферменты денатурируют (изменение конформации, раскручивание). Имеют место сложности в очистке ферментов.

На активность ферментов, а следовательно и на скорость реакции ферментативного катализа оказывают влияние: концентрация и доступность субстрата; концентрация фермента; температура реакции; рН реакции; продолжительность процесса; наличие ингибиторов или активаторов.

За единицу активности любого фермента принято то его количество, которое катализирует превращение одного микромоля субстрата в 1 минуту при t = 30⁰С по начальной скорости реакции, когда концентрация субстрата достаточна для насыщения фермента. Количество фермента измеряют в мл, г, кг, т.

Промышленные ферментные препараты. Использование микробных ферментов в некоторых отраслях промышленности началось более 70 лет назад. Большую часть составляют гидролазы (реакции гидролиза), так как именно они являются основными в промышленной биотехнологии. От общего количества потребляемых ферментов 99% выпуска приходится на 16 препаратов.

Рассмотрим подробнее некоторые группы ферментов.

К амилолитическим ферментам относятся α-амилаза, β-амилаза, глюкоамилаза. Их действие проявляется при гидролизе крахмала и глюкогена. Крахмал при гидролизе сначала расщепляется на более простые полисахариды – декстрины, а затем - до глюкозы.

α-амилаза гидролизует любые α-1,4-глюкановые связи (амилаза, амилопектин, гликоген); β-амилаза - фермент концевого действия, последовательно отщепляет остатки дисахарида мальтозы от концов цепей. Глюкоамилаза гидролизует крахмал с образованием глюкозы и небольшого количества декстринов. Эти ферменты применяются в спиртовой промышленности, хлебопечении.

Протеолитические ферменты относятся к гидролазам, образуя группу пептидгидролаз. Их действие заключается в ускорении гидролиза пептидных связей в белках и пептидах. Важная их особенность - выборочный, селективный характер действия на пептидные связи в белковой молекуле. Например, пепсин действует только на связь с ароматическими аминокислотами, трипсин - только на связь между аргинином и лизином. Из них рН 1,5-3,7 имеют кислые протеазы; рН 6,5-7,5 - протеазы; рН> 8,0 - щелочные протеазы.

Применение протеаз широкое: мясная промышленность для умягчения мяса, кожевенная промышленность - при обезволошивании (удаление волосяного покрова) и мягчении шкур; кинопроизводство - для растворения желатинового слоя на пленках при их регенерации; парфюмерия – при создании добавок в зубную пасту, кремы, лосьоны, промышленность синтетических моющих средств – при применении моющих добавок для удаления загрязнений белковой природы; медицина – при лечении воспалительных процессов, ожогов, тромбозов.

Пектолитические ферменты объединены в одну группу по внешнему проявлению своего действия – уменьшению молекулярной массы и снижению вязкости пектиновых веществ (пектин – пектиновые кислоты и протопектин) представителей полисахаридов. Они содержатся во фруктах, корнеплодах, стеблях (лен). Пектиновые вещества имеют молекулярную массу от 20000 до 200000. Все пектиназы делятся на два вида – гидролазы и трансэлиминазы. Первые отщепляют метильные остатки (пектинэстеразы) или разрывают α–1.4–гликозидные связи (полигалактуроназы). Вторые ускоряют негидролитическое расщепление пектиновых веществ с образованием двойных связей. Применение в текстильной промышленности – вымачивание льна перед его переработкой, в виноделии – осветление вин, уничтожение мутности, в консервировании – при приготовлении фруктовых соков.

Целлюлолитические ферменты очень специфичны, их действие проявляется лишь в деполимеризации молекул целлюлозы, обычно они действуют в виде комплекса, который в целом доводит гидролиз целлюлозы до глюкозы. Использование их очень перспективно в гидролизной промышленности – это получение глюкозы из целлюлозы; в медицинской – выделение лекарственных веществ (стероидов) из растений; в пищевой – улучшение качества растительных масел; в сельском хозяйстве – как добавки в комбикорма для жвачных животных. В мире производится около 530 т протеаз, 350 т глюкоамилазы, 350 т α–амилазы, 70 т глюкозоизомеразы.

 

Лекция 14. Иммобилизованные ферменты.

Вопросы. 1. Процессы, в которых используются иммобилизованные ферменты и клетки. 2. Носители для иммобилизации ферментов. 3. Биоконверсия растительного сырья. 3. Методы физической и химической иммобилизации ферментов. Иммобилизации путем включения в полимерную структуру инкапсулирования и поперечных сшивок.

Факторы, влияющие на биосинтез ферментов. Существует мнение, что из клеток микроорганизмов можно выделить любые из известных ферментов. Большинство микроорганизмов способно расти на относительно простых и дешевых питательных средах. Преодоление трудностей, связанных с их производством и использованием, связано с получением иммобилизованных ферментов.

Иммобилизация ферментов – это перевод их в нерастворимое состояние с сохранением (частичным или полным) каталитической активности.

Для получения иммобилизованных ферментов обычно применяют следующие методы:

1. Ковалентные присоединение молекул ферментов к водонерастворимому носителю, в качестве которого используют как органические (природные и синтетические) полимеры, так и неорганические материалы. К первым относятся целлюлоза, хитин, агароза, декстрины, бумага, ткани, полистирол, ионообменные смолы и т. д., ко вторым – пористое стекло, силикагели, силохромы, керамика, металлы и т. д.

2. Захват фермента в сетку геля или полимера.

3. Ковалентная сшивка молекул фермента друг с другом или с инертными белками (при помощи би – или полифункционального реагента).

4. Адсорбция фермента на водонерастворимых носителях (часто на ионитах).

5. Микрокапсулирование (захват раствора фермента в полупроницаемые капсулы размером 5-300 мкМ).

В результате иммобилизации ферменты приобретают преимущества гетерогенных катализаторов. Их можно удалять из реакционной смеси и отделять от субстратов и продуктов ферментативной реакции) простой фильтрацией.

Иммобилизованные ферменты более устойчивы к внешним воздействиям, чем растворимые ферменты.

Принцип иммобилизации был применен не только к ферментам, но и к их субстратам – веществам, имеющим избирательное средство к ферментам. Это позволило создать метод выделения и очистки ферментов, основанный на хроматографии по сродству. Облегчилось выделение чистых ферментов.

В последнее время применяют иммобилизованные клетки микроорганизмов, содержащих естественный набор ферментов. Отпадают стадии выделения, очистки и иммобилизации ферментов. Ферменты в микроорганизме находятся в наиболее естественном окружении, что положительно сказывается на их термостабильности и операционной стабильности (продолжительности работы в условиях опыта). Ферменты в составе клеток микроорганизмов долго сохраняют каталитические свойства. Они также являются гетерогенными биокатализаторами со всеми преимуществами их использования в технологических целях.

Иммобилизация клеток обычно проводится их адсорбцией на водонерастворимых носителях (часто на ионообменных смолах), ковалентной сшивкой с помощью бифункциональных реагентов (например, глутарового альдегида) или захвата их в полимер, как правило, с последующим формованием в виде частиц определенного размера и конфигурации.

Иммобилизация целых клеток микроорганизмов предотвращает их размножение и обычно увеличивает сохранность и срок работы в качестве катализатора по сравнению с необработанными клетками.

Для интенсификации процесса роста и синтеза ферментов часто добавляют всевозможные вытяжки или экстракты, содержащие дополнительные факторы роста. К ним относятся прежде всего аминокислоты. Они легко проникают внутрь клетки и специфически влияют на образование фермента. Механизм их действия заключается в компенсации недостающих свободных внутриклеточных аминокислот, необходимых для синтеза фермента. Факторами роста являются также пуриновые основания и их производные, РНК и продукты ее гидролиза. Существенное влияние оказывают минеральные соли Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, Cu²⁺ и некоторых других металлов. Ионы Са повышают устойчивость α–амилазы, ионы Fe и Mg активизируют и стабилизируют протеолитические ферменты; Fe²⁺ и Cu²⁺ участвуют в реакциях, связанных с утилизацией и превращением энергии.

Понятие о биоконверсии

Биоконверсия заключается в превращении метаболитов в структурно-родственные соединения под действием микробных клеток. Тем самым микроорганизмы могут влиять только на отдельные стадии сложных процессов химического синтеза, уменьшать количество стадий.

Один из древнейших видов биоконверсии - превращение этилового спирта в уксусную кислоту, которое происходит при получении уксуса. Использование этого процесса, осуществляемого Gluconobacter suboxidans, можно проследить вплоть до Древнего Вавилона (5000 лет до н. э.).

Биоконверсии чрезвычайно специфичны, поскольку они имеют дело с одним типом реакции и с соединением определенной структуры (стереоспецифичность). В ходе биоконверсий происходит превращение изопропанола в ацетон, глицерина в дигидроксиацетон, глюкозы в глюконовую кислоту и затем в 2–кетоглюконовую или 5–кетоглюконовую кислоты и сорбита в L–сорбозу. Биоконверсия сорбита в сорбозу – единственная биологическая реакция в химическом производстве аскорбиновой кислоты (витамина С).

Применение методов, основанных на биоконверсии, наиболее полно иллюстрирует история синтеза стероидных гормонов. В 1930-х г.г. Кендалл и Райхштейн выделили из надпочечников кортизон. Десятилетием позже Кенч установил, что кортизон эффективен при лечении ревматоидного артрита. Химический синтез кортизона состоит из 37 стадий и 1 г вещества, произведенного таким способом, стоит 200 долл. Одна из ключевых стадий синтеза состоит во введении атома кислорода в положение 11 L стероидного ядра; эта стадия необходима для создания физиологически активной молекулы. В 1952 г. Петерсон и Мюррей обнаружили, что штамм грибов Rhizopus arrhizus способен гидроксилировать прогестерон и тем самым вводить атом кислорода в положение 11 L. При помощи штамма грибов Rhizopus arrhizus синтез кортизона сократился до 11 стадий вместо 37 при химическом синтезе, а стоимость гормона упала с 200 до 6 долл. за 1 г. Другие преимущества микробной конверсии заключались в том, что брожение происходило при 37⁰С в водной среде и при атмосферном давлении, тогда как химический синтез кортизона требовал экстремальных температур и давления. Сегодня любой атом углерода стероидного ядра можно гидроксилировать при помощи определенных микроорганизмов. Микроорганизмы находят также применение при производстве сырья для получения стероидов. Таким сырьем являются стерины, их основными источниками служат диосгенин из корней ямса и стигмастерин и ситостерин, экстрагируемые из жмыха соевых бобов.

Иногда для биоконверсии требуются смешанные культуры или последовательное добавление микробных штаммов или видов, каждый из которых осуществляет специфическую стадию биоконверсии. Использование иммобилизованных клеток, более стабильных, чем ферменты или клеточные культуры, дает возможность повысить эффективность биоконверсии и уменьшить ее стоимость. Это поможет в решении проблем, связанных с нерастворимостью субстратов, таких как стероиды.