Определение концентрации ХС-ЛВП (холестерина-липопротеидов высокой плотности) (HDL) в сыворотке и плазме крови

 

ПРИНЦИП МЕТОДА.Хиломикроны, липопротеиды низкой плотности (LDL) и липопротеиды очень низкой плотности (V LDL) осаждаются при добавлении к образцу фосфовольфрамат/Mg²⁺. После центрифугирования в супернатанте остаются толькоHDL, концентрация которых определяется так же как концентрация общего холестерина.

 Набор реагентов: HDL CHOLESTEROL «FL - E» («Vital-Diagnostics»)

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

1. Преципитация

Реагенты	Опытные пробы, (мл.)	Калибровочные пробы, (мл.)	Контрольные пробы, (мл.)
Сыворотка или плазма	0,15	_	_
H2O	_	_	0,15
Осаждающий реагент	0,3	0,3	0,3
Раствор холестерина	_	0,15	_

 

Хорошо перемешать и оставить на 10 мин при комнатной температуре. Опытные пробы отцентрифугировать в течение 10 мин при 4000g или 1-2 мин 1000g. Прозрачный супернатант использовать для определения концентрации HDL. Калибровочные и контрольные пробы центрифугировать не нужно. Определение холестерина во всех пробах в течение часа.

 

2. Определение концентрации HDL

Реагенты	Опытные пробы, (мл.)	Калибровочные пробы, (мл.)	Контрольные пробы, (мл.)
Супернатант	0,2	_	-
H2O+ реагент №1	_	_	0,2
Рабочий реагент для определ. холестерина	0,2	0,2	0,2
Раствор холестерина+реагент №1	_	0,2	_

 

Реакционную смесь тщательно перемешивают и инкубируют не менее 10 мин при комнатной температуре (20-25°С) или 5 мин при 37°С и измеряют оптическую плотность опытных и калибровочных проб против контрольной пробы в кювете с толщиной поглощающего слоя 5 см (1 см.) при длине волны 500 нм (ФЭК- 490 нм). Окраска стабильна не менее 2-х часов после окончания инкубации при предохранении от прямого солнечного света.

Расчет концентрации (С) холестерина HDL проводят по формуле:

С = Е_о/Е_{ст *} 1,29 (ммоль/л) или С = Е_о/Е_{ст *} 50 (мг/100 мл) Е_о и Е_ст – экстинция образца и стандарта, измеряется относительно контрольной пробы.

 

Определение ХС-ЛОНП (холестерина-липопротеидов очень низкой плотности) расчетным методом

 

Уровень ХС-ЛОНП находят путем деления показателя концентрации триацилглицеринов на 2,2 (ТГ/2,2). Вывод этой формулы расчетов базируется на том, что, во-первых, при отсутствии в крови хиломикронов (а они после 12-часового голодания у большинства пациентов не выявляются) практически все количество ТГ крови сосредоточено в ЛОНП и,во-вторых, при не слишком высокой концентрации в крови (когда содержание ТГ не привышает 4,4 ммоль/л)  в частицах ЛОНП на 22 молекулы ТГ приходится 10 молекул холестерола [12]. 

Определение ХС-ЛНП (холестерина липопротеидов низкой плотности) расчетным методом

 

  Зная уровень ХС_общ плазмы, ХС-ЛВП и ХС-ЛОНП, нетрудно определить содержание ХС-ЛНП по формуле [12]:

ХС-ЛНП = ХС - (ХС-ЛВП + ХС-ЛОНП)

Определение индекса атерогенности (ИА) расчетным методом

Расчет индекса атерогенности призводят по формуле:

ХС_пл – £-ХС /£-ХС Х (ЭХС/СХС)

ХС_пл – общий холестерол плазмы

£-ХС (альфа-ХС) – холестерол супернатанта (ЛПВП)

ЭХС/СХС – отношение содержания эфиросвязанного и свободного холестерола супернатанта плазмы [12].

Определение содержания диеновых коньюгатов(ДК)  в эритроцитах

 

За основу взят классический метод Placer в модификации Гаврилова В. Б. [9] для эритроцитов. 0,5 мл гемолизата эритроцитов (1:1) смешивают в пробирках с притертой крышкой с 4 мл чистоперегнанных растворов изопропанол: гептан (1:1). Смесь встряхивают постоянно не менее одного часа затем добавляют 1 мл HCl (pH=2) после чего еще раз встряхивают две минуты, добавляют 2 мл чисто перегнанного гептана и снова встряхивают 10-15 мин. Примерно через 1-2 часа отбирают верхнюю фазу и фотометрируют при 232нм против контрольной пробы (А_фон) где вместо гемолизата взято 0,5 мл H₂O. Коэффициент экстинции при 233 нм –

2,2 * 10 ^-5 см^-1 М^-1. Формула для расчета: С(нмоль/мл эр)= (А_оп - А_фон) * 36,4

 

Определение содержания ДК в плазме крови и гомогенате печени

 

За основу взят классический метод Гаврилова В.Б. и соавт [9], Владимирова Ю.А. и соавт. [7]. 0,4 мл плазмы вносят в пробирку с плотной крышкой и добавляют 4 мл чисто перегнанной смеси изопропанол: гептан (1:1). Смесь встряхивают в течение 20-30 мин затем добавляют 1 мл HCl (pH=2) после чего еще раз встряхивают две минуты, добавляют 2 мл чисто перегнанного гептана и снова встряхивают 10-15 мин. Примерно через час отбирают верхнюю фазу и фотометрируют при 232 нм против контрольной пробы где вместо гемолизата взято 0,2 мл H₂O. Коэффициент экстинции 2,2 * 10 ^-5 см^-1 М^-1. Формула для расчета (при l=1 см):

С(нмоль/мл пл) = [(∆А* 10⁶)/(2,2*10⁵*1)]*[4/V_проб], где: ∆А = А_оп - А_фон, 2,2*10⁵ – коэффициент экстинции, 1 (см) = L (толщина кюветы), 2 (мл) = V_гепт (объем гептана)

Определение содержания малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах

 

За основу взят классический метод Ernster et al [25] в модификации для эритроцитов. 0,5 мл гемолизата эритроцитов (1:1) смешивают с 1 мл охлажденной 5% ТХУ и тщательно растирают смесь стеклянной палочкой. После выдерживают при 0±5 °С не менее 1-2 часов смесь центрифугируют при 4000 g 30 мин. Далее тщательно отбирают 0,4мл надосадка в пробирки для кипячения и добавляют 1,0 мл 0,5% тиобарбитуровой кислоты. Смесь инкубируют в кипящей воде более 10 мин после чего охлаждают и фотометрируют при 532 нм против соответствующего контроля. В расчет принимают коэффициент молярной экститнции – 1,56*10⁵ см^-1 М^-1. С(нмоль/мл эр) = ∆А * 115,8