Изучение морфолого-физиологических и культуральных свойств микроорганизмов

Целью данного этапа эксперимента являлось выделение, изучение свойств микроорганизмов и определение их видовой принадлежности. Исследуемые культуры были выделены из сточной воды после эмульсионного обезжиривания меховой овчины. Изучаемые культуры были обозначены номерами 3,7, F, G, I, I¢. Получение чистых культур прокариотических микроорганизмов проводили путем изолирования отдельных клеток на плотной питательной среде, используя метод посева штрихом и метод разведения. Для получения чистых культур методом посева штриха, петлей с культурой зигзагом наносили на поверхность среды. Синтетическую среду готовили в соответствии с п. 2.2.1. с иcпользованием в качестве источника углерода СПАВ «Превоцелл-W-OF-7» в количестве 1 г/л. Для получения единичных колоний методом разведения в чашки Петри вносили 0,1 см³ разведенной культуры и равномерно распределяли с помощью стеклянного шпателя по всей поверхности. Чашки Петри с культурами инкубировали в перевернутом виде в термостате в течение 24 ч при постоянной температуре (38±0,5)⁰С.

В ходе эксперимента готовили синтетические среды с содержанием импортного и отечественного агар-агара в соотношении 1:1 и 1,5:0,5. Агар-агар отечественного производства содержит большое количество органической примеси, которая служит дополнительным источником питания микроорганизмов, а в импортном – практически отсутствуют. Для восстановления жизненно важных функций и определения морфолого-физиологических свойств микроорганизмов методом 10-ти кратного разведения культуры пересевали на чашки Петри, где в качестве питательной среды использовали мясопептонный агар (МПА).

Синтетические среды с содержанием 1:1 и 1,5:0,5 импортного и отечественного агар-агара обозначили буквами В и С соответственно, а мясопептонный бульон-А. Изменение культуральных свойств в зависимости от вида питательной среды представлено в табл. 3.

Как видно из данных, представленных в табл. 3, с изменением состава синтетической среды (с В на С) колоний практически не изменяется и колеблется от белого до желтоватого. Форма колоний – круглая, но с уменьшением содержания органической примеси у культур I и I’ форма оставалась без изменений, но с валиком по краям и фестончатым краем соответственно. Профиль и поверхность колоний не менялись. У культур I и I’ размеры переходят от точечных до средней величины. А также структура колоний I’ переходит из однородной (среда В) в мелкозернистую (среда С).

На МПА культуры имели, в основном, круглую форму, но с разнообразными краями – гладкими (колонии 3, F, G) и ворсистыми (7, I, I’). Поверхность выросшие культуры имели гладкую, за исключением F, I (шероховатая). Все колонии имели точечные размеры (диаметр менее 1 мм), кроме I (средней величины d>1 мм). Цвет изменяется от белого до желтого. Структура колоний 3,7, G была однородной, а у культур F, I, I’ – мелкозернистой. Из табл. 3 видно, что с изменением соотношения агар-агара импортного и отечественного производства lg КОЕ снижается. Так, например, для культуры 3 данный показатель уменьшается с 7,62 до 6,48. На среде МПА максимальный lg КОЕ наблюдается у культуры 3 (27,82), а минимальный – у I’ (18,04).

Далее определяли такие морфолого-физиологические признаки микроорганизмов, как спорообразование, подвижность, разжижение желатина, наличие сероводорода, аммиака, каталазы, а также редуцирующую способность. Данные определений представлены в табл. 4.

Далее провели исследования колоний на тинкториальную способность (окраска по Граму и подвижность). Окраска по Граму является дифференциально-диагностической и зависит от содержания в клеточной стенке гликолипида муреина, представляющего собой гетерополимер, который в свою очередь состоит из чередующихся остатков N-ацетилглюкозоамина и N – ацетилмурамовой кислоты и пептидов. Грамположительная окраска указывает на наличие небольшого количества полисахаридов, липидов и белков и характерна для всех выделенных культур. Исследование подвижности показало, что для микроорганизмов типа 3,7, I характерен лофотрихиальный тип движения, культуре F – перетрихиальный, G – монотрихиальный. А для культуры I’ характерен как монотрихиальный, так и лофотрихиальный тип движения.

Протеолитические свойства микроорганизмов изучали посевом в мясопептонный желатин (МПЖ) согласно п. 2.2.5. Выделенные культуры, кроме F, обладают протеолитическими свойствами, т. к. разжижают МПЖ. Для обнаружения сероводорода делали посев уколом пристеночно в агар-агар с уксуснокислым свинцом (п. 2.2.5.1.). Если культура при разложении белка выделяет сероводород, то появляется темно-бурое окрашивание (почернение) по месту укола в плотной среде. Культуры 3, F, I выделяют сероводород, а остальные – нет. Ни одна культура не выделяет аммиак, определение которого проводили в соответствии с п. 2.2.5.2. при наличии фермента каталазы при действии перекиси водорода обнаруживают обильное выделение пузырьков отщепленного кислорода, т.е. образуется «пенистая шапка». Каталаза присутствует во всех выделенных культурах. Редуцирующей способностью (обесцвечивание молока с метиленовым синим) обладают все культуры, за исключением I.

На основе исследования свойств микроорганизмов определили их видовую принадлежность /53/. Бактерии рода Listeria представляют собой короткие палочки правильной формы с закругленными краями. Грамположительные, неспорообразующие, каталазоположительные. Следовательно, культуры 3, 7, G, I’ можно отнести к данному роду, т. к. они имели форму коротких палочек, окрасились в фиолетовый цвет (грамположительные) и не образовывали при определении каталазы «пенистую шапку». Данные микроорганизмы широко распространены в окружающей среде, некоторые виды патогенны для человека и животных.

Культуру F можно отнести к роду Brochotrix. Данные микроорганизмы имеют палочки правильной формы в цепочках, грамположительные и каталазоположительные. Эти признаки наблюдались при изучении свойств культуры F. Данные организмы широко распространены в природе.

Бактерии рода Bacillus имеют форму прямых палочек с закругленными концами, грамположительные, подвижные и образующие овальные эндоспоры, каталазоположительные. Как видно из данных табл. 4, все эти признаки относятся к культуре I. Данные микроорганизмы обнаруживаются в разнообразных местообитаниях, некоторые виды патогенны для позвоночных и беспозвоночных.

Липолитические свойства микроорганизмов определяли посевом в бульон Штерна, где в качестве единственного источника углерода использовали оливковое масло с концентрацией 1 см³/100 см³ бульона. Бактерии, обладающие липолитическими свойствами, при ферментации оливкового масла извлекают из него альдегиды, подкисляя среду, при этом окраска бульона переходит из золотисто-желтой в розовую. Стерильный бульон Штерна разливали в пробирки по 10 см³ в каждую и вносили исследуемые культуры. Пробирки с микроорганизмами термостатировали при температуре (38±0,5)⁰С. В течение 120 ч проводили визуальные наблюдения за изменением физических свойств бульона Штерна, которые выражались в образовании хлопьев, а также в изменении цвета и прозрачности. В качестве контрольного варианта использовали состав, включающий в себя бульон Штерна без введения микроорганизмов. Результаты наблюдений представлены в табл. 5.

Таблица 5. Влияние типов бактерий на свойства бульона Штерна

Как видно из данных, представленных в табл. 5, практически для всех типов микроорганизмов в процессе культивирования не наблюдалось образование хлопьевидного осадка, за исключением культур 7, G. Для них характерно появление хлопков вследствие продуцирования экзоферментов в последние 72–120 ч. Использование оливкового масла бактериями в качестве источника энергии и углерода подтверждалось переходом окраски из золотисто-желтой в розовую, за счет образования в результате деструкции жировых веществ, альдегидов и жирных кислот, что вело к понижению величины рН. Данная зависимость наблюдалась для культур I¢, 7, G через 72–96 ч культивирования. Изменение прозрачности бульона, в основном, через 48 ч у всех культур, кроме контрольного варианта, свидетельствовало об интенсивном росте и развитии микроорганизмов.

Таким образом, в результате проведения данной части дипломной работы были исследованы морфолого-физиологические и культуральные свойства микроорганизмов и определена их видовая принадлежность. Так культуры 3,7, I¢ относятся к роду Listeria, F- к роду Brochotrix, I – к Bacillus.