Определение протеолитической активности (метод Вильштеттера и Вальдшмидт – Лейтца в модификации)

Данный метод основан на определении свободных карбоксильных групп в спиртовых растворах аминокислот и полипептидов.

Протеолитическую активность выражают количеством миллиграммов аминного азота, которое образуется при гидролизе определенного количества 5%-го раствора желатина с рН 7,3–7,5 1 см³ ферментного раствора за 1 ч при температуре 40°С. За единицу протеолитической активности принимают количество фермента, которое образует 1 см³ аминного азота за 1 ч в принятых условиях опыта.

Для проведения анализа необходимы реактивы: фосфатный буферный раствор с рН 7,3–7,5; 5%-ный раствор желатина (субстрат) – 5 г желатина предварительно замачивают в стеклянном стаканчике в 15–20 см³ дистиллированной воды в течение 20–30 мин. Набухший белок заливают 20–25 см³ буферного раствора температурой 70–80°С и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Растворившуюся часть сливают в мерную колбу на 100 см³ к не растворившейся части добавляют еще 20–25 см³ буферного раствора и снова переносят полученный раствор в эту же колбу. Так повторяют до полного растворения желатина. Охлажденный до 40°С раствор желатина доводят до метки буферным раствором такой же температуры.

Перед анализом раствор желатина нагревают до 40°С на водяной бане; 1%-ный спиртовой раствор тимолфталеина – 1 г кристаллического тимолфталеина растворяют в 96% спирте-ректификате в мерной колбе на 100 см³ и после растворения доводят до метки; 0,1 н раствор щелочи; 96%-ный этиловый спирт.

К 10 см³ 5%-ного раствора желатина с рН 7,3–7,5 приливают 2 см³ испытуемого ферментного раствора и сразу не отбирают 1 см³ реакционной смеси в коническую колбу на 50–100 см³, куда предварительно налито 20 см³ 96%-ного этилового спирта и 0,2 см³ 1%-ного раствора тимолфталеина. Пробу тут же титруют 0,1 н раствором щелочи. После появления голубой окраски в растворе прибавляют еще 4 капли щелочи и на этом титрование заканчивают. Титрование проводят из микробюретки с ценой деления 0,02 см³.

Оставшуюся смесь желатина с ферментным раствором помещают в термостат с температурой 40°С для гидролиза. Через 3 ч 1 см³ реакционной смеси отбирают во вторую коническую колбу на 50–100 см³, куда предварительно налито 20 см³ 96%-ного этилового спирта и 0,2 см³ 1%-ного раствора тимолфталеина и титруют аналогично контролю.

Расчет протеолитической активности (ПС) ведут по формуле (2):

 

А

ПС = –, (2)

(t ´P)

 

где ПС – протеолитическая активность, ед/г;

А – количество аминного азота, накопленное за время опыта в реакционной смеси, мг;

t – время протеолиза, ч;

Р – коэффициент, учитывающий разведение и пересчет на 1 г препарата или 1 см³ жидкого ферментного препарата.

Величина А рассчитывается по формуле (3):

 

А = (а – а_к) ´1,4 ´К, (3)

 

где а – количество 0,1 н раствора щелочи, пошедшее на титрование 1 см³ раствора опытного, см³;

а_к – количество 0,1 н раствора щелочи, пошедшее на титрование 1 см³ контрольной пробы, см³;

1,4 – коэффициент пересчета количества 0,1 н раствора щелочи в миллиграммы азота аминокислот и полипептидов;

К – поправка к титру щелочи.

 

Определение содержания СПАВ

Для определения содержания в сточной воде анионактивных СПАВ применяют фотометрический метод, основанный на том, что эти СПАВ образуют с метиленовым голубым комплексные ассоциаты, растворяющиеся в хлороформе с образованием синих растворов. Сам метиленовый голубой в хлороформе не растворяется.

Приготовление рабочего раствора: 10 см³ стандартного раствора разбавляют дистиллированной водой до 1 дм³.

Построение калибровочного графика: в ряд делительных воронок, содержащих 100 см³ дистиллированной воды, помещают 0; 0,5; 1,0; 2,0;…; 16,0; 20,0 см³ рабочего раствора. В каждую воронку добавляют по 10 см³ буферного раствора, перемешивают и приливают по 5 см³ нейтрального раствора метиленового голубого и по 15 см³ хлороформа, снова перемешивают в течение 2 минут.

Во второй ряд делительных воронок наливают 100 см³ дистиллированной воды и по 5 см³ кислого раствора метиленового голубого. В эти же воронки спускают отстоявшийся хлороформный слой из первого ряда воронок. В первые воронки наливают еще по 5 см³ хлороформа, взбалтывают в течении 2 минут и после отстаивания сливают хлороформные вытяжки во второй ряд делительных воронок. Эту операцию повторяют еще раз. Если хлороформ не окрашивается, значит извлечение комплекса окончено.

Содержимое второго ряда воронок взбалтывают в течении 2 минут и после расслоения спускают хлороформный слой в мерные колбы вместимостью 50 см³ через воронки с кусочками ваты для отделения возможно образовавшейся мути. В делительные воронки наливают еще по 5 см³ хлороформа, взбалтывают 2 минуты и после расслоения спускют хлороформ в мерные колбы. Эту операцию повторяют еще раз. Объем экстракта в мерных колбах доводят до метки хлороформом, перемешивают и определяют оптическую плотность окрашенных растворов на фотоколориметре с красным светофильтром (l=650 нм) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 20 мм.

При определении содержания анионактивного СПАВ в сточной воде 100 см³ хорошо перемешанной сточной воды помещают в делительную воронку. Если объем пробы меньше 100 см³ его доводят до 100 см³ дистиллированной водой. В делительную воронку вливают 10 см³ фосфатно-буферного раствора, 5 см³ нейтрального раствора метиленового голубого, 15 см³ хлороформа и далее все операции проводят, указанные при построении калибровочного графика.

Параллельно проводят холостой опыт со 100 см³ дистиллированной воды.

Если оптическая плотность превышает максимальное значение калибровочного графика, то отбирают аликвотную часть хлороформного экстракта и разбавляют хлороформом. Таким же образом разбавляют и раствор холостого опыта.

Калибровочный график представлен на рис. 2.

Содержание анионактивных СПАВ определяют по формуле (4):

 

С´1000

Х= –, (4)

V

 

где Х-содержание аниононактивных СПАВ, мг/см³;

С-содержание СПАВ, найденное по калибровочному графику, мг;

V – объем сточной воды, взятый для анализа, см³;

1000-перевод в дм³.

Неионогенный СПАВ реагирует с роданокобальтом аммония, образуя комплексные вещества синей окраски, растворимые в хлороформе, роданокобальтата аммония в хлороформе нерастворим. Чувствительность реакции невелика, но поскольку определяемые вещества нелетучи, возможно предварительное концентрарование путем выпаривания анализируемой воды досуха и растворением остатка в спирте и воде.

Приготовление стандартного раствора: 1 г применяемого неионогенного СПАВ растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 500 см³.

Построение калибровочного графика: отбирают 0; 0,5; 1; 2; 3; 4 и 5 cм³ стандартного раствора, доводят объем до 5 см³ и переносят в ряд делительных воронок вместимостью 50 см³, в которые предварительно налито по 20 см³ раствора роданокобальтата аммония. Содержимое воронки взбалтывают 1 минуту и дают постоять 5 минут. Затем прибавляют 4 см³ хлороформа, взбалтывают 1 минут и оставляют до расслаивания жидкости. Слой хлороформа сливают через воронку, в которую предварительно вкладывают кусочек ваты, пропитанный хлороформом, в калибровочную пробирку вместимостью 10 см³. Извлечение окрашенного комплекса повторяют дважды, используя порции хлороформа объемом 4 и 2 см³ и, собирая хлороформные экстракты в ту же пробирку. Пробирку опускают на 5 минут в водяную баню при температуре 20⁰С и, если надо, доливают хлороформ до метки и перемешивают.

Оптические плотности полученных хлороформных экстрактов определяют на фотоколориметре с оранжевым светофильтром (l=610 нм) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 30 мм. По полученным данным строят калибровочный график зависимости оптической плотности от содержания неионогенного СПАВ.

Калибровочный график представлен на рис. 3.

Содержание неионогенного СПАВ определяют по формуле (5):

 

С´1000

Х= –, (5)

V

 

где Х-содержание неиногенного СПАВ, мг/дм³;

С-содержание неионогенного вещества, найденное по калибровочному графику, мг;

V – объем сточной воды, взятый для анализа (с учетом разбавления или упаривания), см³;

1000-перевод в дм³.

 

Определение рН жидкости

Для измерения рН жидкости используется цифровой ионометр И-120.2. Входное напряжение прибора 220 В, частота 50 Гц. Ионометр предназначен для измерения рН жидкой фазы, температуры, С, градиента, %.

Измерение рН проводили следующим образом: химический стакан на 50 мл наливали 35 мл жидкости исследуемого раствора, погружали электроды, снимали показания. После этого промывали дистиллированной водой и протирали фильтровальной бумагой.