Занятие серологические реакции

Реакция связывания комплемента

а - лизис сенсибилизированных эритроцитов в присутствии комплемента;

б - отсутствие гемолиза вследствие фиксации комплемента комплексом Аг-Ат;

в - лизис эритроцитов в результате отсутствия комплекса Аг-Ат.

Реакция Вассермана (RW) относится к группе реакций связывания комплемента
(А. Р. Wassermann, нем. бактериолог, 1866-1925) - иммунологическая реакция, применяемая в диагностике сифилиса). Результаты реакции Вассермана: а - полная задержка гемолиза (+ + ++); б - выраженная задержка гемолиза (+ ++); в - частичная задержка гемолиза (++); г - слабая задержка гемолиза (+); д - полный гемолиз «лаковая кровь» (-). Реакция положительна при частичной, выраженной и полной задержке гемолиза, определяемой по степени окрашивания содержимого пробирок от светло-розового до ярко-красного. Негемолизированные эритроциты впоследствии образуют осадок красного цвета.

 

Иммунофлюоресцентный метод Кунса

Иммунофлюоресцентный анализ или реакция иммунофлюорисценции(РИФ):
Прямой (метод Кунса)- флюорисцирующие АТ+исследуемый АГ = светящийся комплекс
Непрямой – универсальная флюорисцирующая сыворотка + специфические АТ+исследуемый АГ= ск

Радиоиммунный анализ (РИА) твердофазный (ат на фазе).
Высоко чувствительный метод. Применяют для количественного определения различных веществ: гормонов, белков сыворотки крови, лекарственных препаратов, микробных антигенов.
Изотоп – ¹²⁵ I – вводится в аг.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

 

Конкурентный вариант ИФА для определения антигенов

Иммунологические планшеты, используемые для постановки ИФА
Автоматический биохимический и иммуноферментный анализатор

Занятие СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

Сложности диагностики - получение ложноотрицательного результата:
неправильное взятие материала,
несвоевременная доставки его в лабораторию,
несовершенная методика бактериологического исследования
угнетение жизнеспособности или гибели возбудителя под действием проводимого лечения (если материал берется не в первые дни заболевания, а уже на фоне этиотропной терапии)

получение ложноположительного результата:
контаминация материала
бактериооносительство
выделение условно-патогенных микроорганизмов

Выделенный микроорганизм является возбудителем:
триада Коха, многократности обнаружения данных видов,
массивности их роста в посевах на плотные питательные среды,
антигенной и фаговаровой однородности выделяемых субкультур
диагностического нарастания титров гомологичных антител при серологических исследованиях.

Микробиологические методы диагностики делятся на:
методы прямого обнаружения возбудителя в организме больного — бактериоскопическое и бактериологическое исследования;
методы косвенного доказательства наличия возбудителя в организме больного — серологические исследования, направленные на обнаружение специфических антигенов в инфицированном материале или антител в сыворотке крови и различных секретах организма больного.

Бактериоскопическое исследование Бактериологический метод

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ, СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ (лат. serum сыворотка + logos учение) – методы изучения определенных антител в сыворотке крови больных,выявления антигенов микроорганизмов или тканей с целью их идентификации, основанные на реакциях иммунитета.

Строение антител (Ig) Строение и классы иммуноглобулинов

В основе серологических реакций лежит специфическое взаимодействие антигена с антителом.

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ТЕСТ-СИСТЕМЫ
При определении антигена - минимальная концентрация вещества, определяемая данной тест-системой.
При определении антител – процент образцов, давших положительный результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных образцов, содержащих выявляемые антитела.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ  ТЕСТ-СИСТЕМЫ
Процент образцов, давших отрицательный результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных образцов, действительно не содержащих выявляемый маркёр.

ППЗ и ОПЗ
Положительное прогнозируемое значение (ППЗ) – вероятность того, что пациент с положительным результатом анализа действительно болен (инфицирован).
Отрицательное прогнозируемое значение (ОПЗ) – вероятность того, что пациент с отрицательным результатом анализа действительно здоров (не инфицирован).

\\ЗАВИСИМОСТЬ ППЗ И ОПЗ ОТ РАСПРОСТРАНЁННОСТИ ЗАБОЛЕВАНИЯ\\

Варианты серологических реакций:
- Прямые, основаны на взаимодействии антигена с антителом (агглютинация, преципитация)
- Опосредованные реакции или непрямые, взаимодействие атнигена и антитела через посредника (реакция непрямой гемагглютинации, реакция связывания комплемента)
- Реакции с использованием меченых антител или антигенов (иммуноферментный, радиоиммунный анализ, метод флюоресцирующих антител).

Реакция агглютинации, варианты:
Ориентировочная
Развернутая РА
Реакция Кастеллани
РНГА
РЛА
Реакция Кумбса
Ко-агглютинации

1) Реакция агглютинации (ориентировочная, для идентификации микроорганизма).
1. Физ. р-р + культура микроорганизмов
2. Сыворотка (1:100) + культура микроорганизмов
1 - Отсутствие агглютинации, 2 - Наличие агглютинации
Возможна спонтанная агглютинация – R-формы бактерий

2) Развернутая реакция агглютинации

3) метод Кастеллани (A. Castellani, р. 1878 г., итал. врач; син. Кастеллани реакция) — метод извлечения противобактериальных антител из иммунной сыворотки крови путем их сорбции на убитых бактериях соответствующего штамма (удаление АТ, реагирующих с групповыми АГ); применяется для изучения антигенных свойств бактерий, главным образом кишечной группы, а также для изготовления моноспецифических сывороток.
Развернутая реакция агглютинации (метод Кастеллани)
Некоторые микроорганизмы содержат как групповые, так и видовые АГ. Насыщение сыворотки культурой гомологичного (специфического) микроорганизма ведет к полному удалению и специфических и групповых АТ. Однако насыщение сыворотки культурой гетерологичного (родственного) микроба ведет к удалению только групповых АТ. Такая сыворотка будет агглютинировать только гомологичные микроорганизмы.

4) Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) или пассивная гемагглютинация (РПГА) Метод обнаружения и идентификации антигенов или антител, основанный на возникающем в их присутствии феномене агглютинации эритроцитов, на поверхности которых были предварительно адсорбированы соответствующие специфические антитела или антигены.
Отличается большей чувствительностью и специфичностью.
1. АГ (АТ) +эритроциты          нагруженные эритроциты
2. Нагруженные эритроциты + иммунная сыворотка или АГ
Положительная Реакция (зонтик) Отрицательная Реакция (пуговка)

РНГА в иммунологическом планшете на выявление HBsAg.
 Постановка и результат РНГА.
Тест-система для проведения РНГА – норм сыворотка и эритроцит диагностикум

5) Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) - метод идентификации вирусов или выявления противовирусных антител в сыворотке крови больного.
в присутствии иммунной к вирусу сыворотки крови агглютинация эритроцитов отсутствует

 Положительный результат - -торможение гемагглютинации (пуговка);
Отрицательный результат - гемагглютинация (зонтик).
Определение титра антител крови больного по РТГА - Титр антител определяют по последней лунке с положительной РТГА.

6) Реакция латекс-агглютинации (РЛА)

Частицы латекса (искусственные эритроциты) используют в качестве носителя АГ.
 Ревматоидный фактор - это аутоантитела анти-IgG (к Fc-фрагменту IgG), относящиеся к классу IgM. В сыворотке ревматоидный фактор обычно присутствует в виде комплекса с IgG. В высоком титре ревматоидный фактор выявляется в крови у 80% больных с тяжелым прогрессирующим ревматоидным артритом.

7) Реакция коагглютинации (РКА)
В качестве носителя используются:
-  Белок А S. aureus (неспецифически адсорбирует на своей поверхности Fc-фрагменты иммуноглобулина G)
- Белок G стрептококков
- Инертные носители (активированный уголь)

8) Реакция Кумбса  с неполными антителами (бруцеллез, резус-конфликт)

 

Реакция преципитации - Осаждение специфических мелкодисперсных антигенов эквивалентным количеством антител (в присутствии электролита)
Варианты:
в жидкой среде - по типу реакции флокуляции, кольцепреципитации в плотной среде в агаре (геле).
Реакции преципитации:
-кольцепреципитации -------------------------------------------------------------------------------------
 - реакция флокуляции - преципитация в капиллярных пробирках
- реакция преципитации в геле по Оухтерлони--------------------------радиальная иммунодиффузия по Манчини в геле – размер преципитационного кольца зависит от количества аг
- реакция иммуноэлектрофореза (вирусный гепатит, клещевой энцефалит, менингококковая инфекция и др.).

 

 

 

Реакция иммунного лизиса: Реакция связывания комплемента (РСК)
РСК протекает в 2 фазы:
1) Взаимодействие АТ, АГ и комплемента, в результате которого свободный комплемент связывается образовавшимся комплексом АГ—АТ (специфич. фаза);
2)  индикация реакции сенсибилизир. эритроцитами (неспецифич. фаза).
В РСК используют 2 системы: специфич. бактериол., состоящую из АТ (испытуемой сыворотки), АГ и комплемента, а также неспецифич. “индикаторную”, содержащую гемолизин (гемолитич. сыворотка) и взвесь эритроцитов барана. АГ соединяется с АТ только в присутствии комплемента. Если испытуемая сыворотка содержит АТ, гомологичные взятому АГ, то присутствующий в реагирующей смеси комплемент адсорбируется образующимся комплексом АГ—АТ и теряет способность лизировать сенсибилизированные эритроциты, т. е. без комплемента гемолизин (гемолитич. антитело) не разрушает эритроциты (реакция положительная). В тех случаях, когда между АГ и АТ испытуемой сыворотки нет специфич. родства, комплекс не образуется и комплемент остаётся в свободном состоянии. При добавлении гемолитич. системы в этом случае несвязанный комплемент вызывает гемолиз сенсибилизированных эритроцитов (реакция отрицательная).