Занятие Молекулярно-биологические методы диагностики

Строение нуклеотида:

КОМПЛЕМЕНТАРНОСТЬ – последовательность нуклеотидов в одной цепи автоматически определяет строго соответствующую ей последовательность нуклеотидов в КОМПЛЕМЕНТАРНОЙ ей цепи.
Так, азотистое основание Аденин (А) всегда взаимодействует только с комплементарным ему азотистым основанием Тимин (Т) в молекулах ДНК.
Одновременно азотистые основания Гуанин (Г) одной цепи взаимодействует только с комплементарними им азотистыми основаниями Цитозин (Ц) другой цепи ДНК (или Урацил (У) в РНК). Комплементарность оснований обеспечивается системой водородных связей.

ТРЕТИЧНАЯ СТРУКТУРА ДНК варианты форм: линейная, кольцевая, 2-х и 1- цепочечная.

ХРОМАТОСОМ: Нуклеосомный кор содержит октамер гистонов (2 х (Н2а+Н2b+H3+H4)).
Нуклеосомный кор образуется при оборачивании октамера гистонов двунитевой спирализованной ДНК на 1,5 оборота, отдельно включается дополнительный белок- гистон Н1.
Хроматосомы напоминают нанизанные на нитку бусины. Следующий этап- сворачивание в спираль очень длинной последовательности “бус”. Эта спираль, в свою очередь, претерпевает сворачивание в двужильные канаты, из которых образуются гроздья, являющиеся небольшой частью хромосомы:

Молекулярно-биологические методы диагностики
Гибридизация ДНК
Секвенирование ДНК
Лигазная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция

Гибридизация ДНК - Метод Эдварда М. Саузерна и Р. Дэйвиса 1975г.
Southern – южный блоттинг (ДНК) Northern – северный блоттинг (РНК) Western –западный блоттинг (белок) Eastern – вакантно (углеводы и липиды)
blotting – букв. "промокание"
Блоттинг ДНК по Саузерну (1975г) ------------------------------

Использование метода гибридизации:
комплексная диагностика инфекционных заболеваний,
 наследственные дефекты,
установления экспрессии тех или иных генов (в этом случае идет гибридизация с мРНК), то есть отслеживания нарушений обмена веществ.
Недостаток – дорогостоящее оборудование.

Секвенирование - Метод расшифровки нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот (Секвенирование ДНК по Сэнгеру)
Метод расшифровки аминокислотной последовательности в белках
Для диагностики не используется

Лигазная цепная реакция (ЛЦР, LCR - ligase chain reaction) Wu и Wallace в 1989г.
В основе метода лежит способность специфического фермента ДНК-зависимой ДНК-лигазы сшивать (лигировать) цепь ДНК в присутствии АТФ и ионов Mg²⁺ при наличии разрыва фосфодиэфирной связи.
Метод позволяет выявить искомую ДНК в 85-90% случаев.
Использование
Инфекции урогенитального тракта   Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis
Различные вирусные инфекции

Полимера́зная цепна́я реа́кция (ПЦР), Kary Mullis 1983г — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) в биологическом материале (пробе).
Направления генодиагностики (ПЦР):
Медицинская диагностика (инфекционные заболевания, санитарно-показательные микроорганизмы в пищевых продуктах)
Диагностика генетических и онко-заболеваний
Судебная медицина и криминология (идентификация личности, установление отцовства)

ПЦР: компоненты реакции.
ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
Два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента.
Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.
Дезоксинуклеотидтрифосфаты (смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК: dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.
Минеральное масло – предохраняет от испарения и разбрызгивания.

Открытие термостабильной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы) из термофильных бактерий Thermus aquaticus 1989г. Оптимальная температура 72-80^оС
Представитель домена архей - Pyrococcus furiosus. Анаэроб, обитает в термальных источниках с температурой воды 70˚С. Источник Pfu-полимеразы.
Представитель домена архей - Pyrococcus woesei (Zillig 1988). Анаэроб, обитает в термальных источниках с температурой воды 90˚С. Источник Pwo-полимеразы.

1-й этап реакции ПЦР (цикл амплификации) – денатурация, 95 гр, около 2х минут
2 – отжиг праймеров, 55-60 гр, ок 2х минут
3 – синтез новой цепи ДНК, 72 гр (1000 по/мин)

Геометрическая прогрессия нарастания числа амплификонов
Приборы для проведения ПЦР – Амплификатор, Настольная центрифуга (скорость 14 500 об/мин), Термостат - предназначен для термостатирования микропробирок, Настольный ПЦР – бокс, Камера для горизонтального электрофореза S-2N, Флуориметр для детекции результатов ПЦР, позволяющий получить результат, не открывая пробирки, что значительно снижает риск контаминации

Фотография геля, содержащего маркерную ДНК (1) и продукты ПЦР-реакции (2,3). Цифрами показана длина фрагментов ДНК в парах нуклеотидов

Ошибки, встречающиеся при проведении ПЦР-диагностики
Контаминация пробы на стадии отбора материала
Загрязнение пробы примесями, ингибирующими ПЦР
Отбор материала выполнен неадекватно, в пробе отсутствуют клеточные структуры.
Разрушение ДНК при транспортировке и хранении пробы
Потери ДНК во время пробоподготовки
Контаминация в отдельных пробах
Тотальная контаминация

Достоинства ПЦР – анализа:
Высокая скорость
Высокая производительность
Высокая чувствительность и специфичность
Эффективность в отношении диагностики медленно растущих и некультивируемых микроорганизмов

Недостатки ПЦР – анализа:
Узкая направленность (нужно предполагать возбудителя).
Проблема контаминации – строгий режим постановки.
Наличие ингибиторов (гепарин при анализе крови).
Не всегда подходит для контроля после лечения (Обнаруживают как живых, так и умерших м/о), не раньше, чем через 1 месяц.

Занятие ГЕТЕРОГЕННОСТЬ МИКРОБНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ

Критериями, позволяющими отнести бактерии к той или иной таксономической группе, являются:
- морфология микробных клеток (кокки, палочки, извитые);
- отношение к окраске по Граму (грамположительные и грамотрицательные бактерии);
- отношение к кислороду (аэробы, факультативные анаэробы, облигатные анаэробы);
 - способность к образованию капсул и спор.