Технология получения оздоровленного посадочного материала картофеля

Вирусные болезни картофеля снижают урожай на 20-60%, причем чем выше уровень агротехники, тем значительнее потери. В Беларуси наиболее ощутимый ущерб картофелеводству наносят вирусы мозаичной группы Х,S,M, вирус У и вирус скручивания листьев. Поскольку эффективных мер борьбы с вирусными болезнями пока не найдено, основным направлением получения высококачественного семенного материала является его оздоровление в процессе клонального микроразмножения.

Процесс получения оздоровленного семенного материала включает следующие этапы (Банадысев и др. 2002):

определение зараженности образца;

выделение меристемы, термо- или химиотерапия;

регенерация растений из меристемы;

проверка растений на наличие вирусных болезней;

клональное микроразмножение in vitro здоровых растений с периодической проверкой на вирусы;

получение клубневого поколения в условиях защищенного грунта;

репродуцирование семенного материала в полевых условиях с соблюдением комплекса мероприятий, препятствующих повторному заражению вирусными болезнями.

Производство оздоровленного посадочного материала картофеля в Беларуси налажено в БНИИ картофелеводства с 1976 года В настоящее время процесс микроразмножения оздоровленных растений выполняется в республике в более чем 30 лабораториях, что позволило перейти на 6-летнюю схему производства элиты. БНИИ картофелеводства оздоравливает все сорта собственной и иностранной селекции, районированные в республике, ежегодно обеспечивает оздоровленными растениями лаборатории по клональному микроразмножению, включенные в Государственный реестр производителей, заготовителей семян по разделу «Оригинальное семеноводство».

Для оздоровления посадочного материала картофеля используется три основных метода: термотерапия, метод апикальных меристем и химиотерапия. Для термотерапии отбираются клубни, типичные по внешним признакам для данного сорта, не имеющие поверхностных повреждений, без признаков инфекции, моют и размещают в кюветах, заполненных стерильным песком. Кюветы помещают в термобокс, где поддерживается температура 37 0 С и влажность 75%. Через 7-10 дней клубни подкармливают раствором Кнопа и микроэлементов по Мурасиге-Скуга. Ростки в этом случае не буреют. В этиолированных ростах концентрация вирусов ниже, чем в зеленых. Термотерапия клубней в течение 35-50 дней резко снижает, а по отдельным сортам полностью освобождает клубни картофеля от вируса скручивания листьев. Однако этот метод не дает положительного эффекта по освобождению от вирусов Х,S,M,У,А. Установлено, что при использовании термотерапии только 50% растений свободны от вирусов. Есть сведения о том, что термотерапия способствует распространению вироида веретеновидности клубней картофеля.

Ростки клубней, прошедших термотерапию, длиной 2 см и более стерилизуют в 0.1% растворе диацида 3-5 минут, затем 3 раза промывают в стерильной воде. Стерилизовать ростки также можно в 1-6 %-ном растворе гипохлорита кальция или натрия или в 0.1% растворе сулемы. Меристему размером 0.1-0.25 мм вычленяют в ламинар-боксе под микроскопом с 24-кратным увеличением с помощью медицинской иглы. Каждую операцию по вычленению меристемы проводят отдельным простерилизованным инструментом. Меристему высаживают на модифицированную среду Мурасиге-Скуга и культивируют при температуре 24-25 С, освещенности 6 тыс люкс, фотопериоде 16 часов, влажности 70%. За 30-45 дней из меристемы вырастает растение с 5-6 листочками. При сочетании метода апикальных меристем с химиотерапией в состав питательной среды добавляют виразол или 2,5 - олигоаденилаты. Полученное из меристемы растение черенкуют и проводят контроль на наличие вирусной инфекции методами иммуноферментного анализа и электронной микроскопии. В БНИИ картофелеводства разработана оригинальная технология производства оздоровленного материала картофеля с использованием высокоэффективных ингибиторов вирусных болезней из группы 2,5 - олигоаденилатов (2-5А), а также почвозаменяющих субстратов Биона. Олигоаденилаты, синтезированы в Институте биоорганической химии НАН Беларуси, позволяют при оздоровлении картофеля от комплекса вирусов (Х, S, M, У, L) в 3-5 увеличить размер выделяемого экспланта, сократить сроки регенерации растений в 2-3 раза, увеличить выход здоровых растений до 100 %. Растения из меристем получаются за 55-90 дней, из эксплантов - за 20-30 дней. При этом нет необходимости в термотерапии, что уменьшает риск распространения вироида веретеновидности клубней картофеля. Олигоаденилаты обладают высоким уровнем последействия при дальнейшем размножении. Урожайность клубней увеличивается на 20-30%, причем количество клубней семенной фракции возрастает в 1,2 -1,3 раза. На протяжении пяти лет полевого репродуцирования сохраняется способность олигоаденилатов подавлять вирусные болезни.

Оздоровленные растения размножают в культуре in vitro или in vivo. При традиционном размножении in vitro растения черенкуют в условиях ламинар-бокса на черенки с одним листочком, которые помещают на свежую питательную среду Мурасиге- Скуга. Условия культивирования: температура 18-25 0 С, относительная влажность 70%, освещенность 6-8 тысяч люкс, фотопериод -16 часов. За 20-30 дней вырастает растение с корневой системой, готовое к новому черенкованию. Согласно Положению о семеноводстве картофеля РБ допускается не более трех циклов черенкования исходных растений, полученных из БНИИ картофелеводства. Коэффициент размножения зависит от сорта и может изменяться от 4 до 7 и более. Растения, размноженные в условиях in vitro, высаживаются в теплицу для получения клубневого поколения. Возможно и черенкование исходных оздоровленных растений в условиях in vivo. В БНИИ картофелеводства разработана технология микроразмножения картофеля на искусственных почвах Биона, полученных на основе гранулированных и волокнистых ионообменных материалов в Институте физико-органической химии НАН Беларуси. В ионитные субстраты вводятся все минеральные элементы, необходимые для питания растений, что позволяет стабилизировать минеральное питание растений в течение эксплуатации искусственных почв, исключить необходимость подкормок, обеспечивает высокую продуктивность растений. Ионитные субстраты насыпаются в поддоны слоем 3 см. Оздоровленные растения картофеля, выращенные in vitro, черенкуются и высаживаются по схеме 4х 4 см2 и укореняются в течение 20 дней при температуре 20-25 0 С и 16-т часовом фотопериоде. Субстраты увлажняются водопроводной водой, после укоренения растения высаживаются в грунт теплицы для получения первого клубневого поколения. Метод обеспечивает приживаемость растений, близкую к 100 %. Продуктивность растений увеличивается в 1,6-2,3 раза. Лучшими для укоренения картофеля in vivo являются ионитные субстраты Биона -212 и Биона 312.

Для получения первой клубневой репродукции используют зимние или весенние пленочные теплицы. Субстратом служит верховой торф в смеси с песком и дерновой землей в соотношении 3:1:1. Важным мероприятием является борьба с тлями - переносчиками вирусов. Обработки проводят через 7-10 дней. В порядке исключения допускается выращивание первого клубневого поколения в полевых условиях на изолированном участке. Для этого растения подращиваются в теплице (рассада), а затем в последней декаде мая - первой декаде июня высаживаются в поле по схеме 70 х 40.

Модификацией традиционной технологии получения первой клубневой репродукции является технология получения миниклубней, т. е клубней с диаметром 15-30 мм. Основная цель технологии миниклубней - получение максимального количества клубневых единиц с единицы площади без снижения их посевных качеств. Для этой цели используют загущенную схему посадки, высаживая пробирочные растения на гряды шириной 1,5 м по схеме 15х30, 20х30. За счет загущения растений доля клубней с диаметром 15-30 мм увеличивается. Главное преимущество этой технологии - экономия площади теплицы. Метод широко используется в биотехнологическом центре БГСХА и других лабораториях республики.

Клубни с диаметром менее 15 мм (микроклубни) можно использовать для повторной высадки в теплицах или в условиях открытого грунта. Микроклубни можно получить и в культуре in vitro. При этом каждое пробирочное растение дает 1-2 микроклубня. Технология предполагает изменение как химических, так и физических условий культивирования. В состав питательной среды могут вводиться цитокинины (аденин, кинентин), ауксины (НУК), АБК. Содержание сахарозы увеличивается до 40-60 г/л. Для накопления запаса питательных веществ, необходимого при образовании клубней, пробирочные растения культивируют при обычных условиях (температура 18-200С, фотопериод 16 часов, освещенность 6 тысяч люкс). После образования у растений 5-6 листьев создают стрессовые условия, индуцирующие клубнеобразование. Для этого растения переносят в условия рассеянного света или сокращают длину дня до 8-12 часов. Температура снижается до 10-12 0 С. При этом за 30-45 дней происходит образование микроклубней. Микроклубни хранят в холодильнике в стеклянной таре, закрытой плотной бумагой при температуре 2-40 С, где они проходят период покоя. Использование для посадки свежеубранных микроклубней, полученных весной, нецелесообразно, поскольку не будет обеспечена высокая всхожесть в полевых условиях. Перед посадкой клубни 10-20 дней прогревают при температуре 10-200С и освещении до инициации прорастания. Посадку микроклубней производят в почву механизировано с помощью пневматической кукурузной сеялки или вручную на глубину 3-5 см. Урожайность картофеля из микроклубней несколько ниже, чем при посадке миниклубнями. Главное преимущество метода - возможность высадки микроклубней в открытый грунт, что позволяет исключить эксплуатацию дорогостоящих теплиц. Кроме того, возможность хранения микроклубней весной, когда число пробирочных растений увеличивается в геометрической прогрессии, уменьшает сезонность при посадке и создает большие возможности для учета погодных условий. При неблагоприятной для высадки погоде пробирочные растения могут перерастать, что снижает их приживаемость.

Решить проблемы приживаемости пробирочных растений в условиях in vivo помогает и метод рассады. В этом случае пробирочные растения высаживаются в торфоперегнойные горшочки размером 6 х 6 или пластиковые кассеты с диаметром ячейки 5 см. Кассеты практичнее, поскольку облегчают транспортировку и дают возможность многоразового использования. Субстратом служит верховой торф с рН 5.6- 5.8 или его смесь с дерновой землей и песком (3:1:1). Эффективно добавление в состав смеси биогумуса (30-50% от объема). Рассада выращивается 25-30 дней в культуральной комнате или теплице. В первом случае она высаживается в теплицу, во втором - в открытый грунт, обеспечивая приживаемость 95-100 %. При высадке обязателен полив. Технология приемлема для лабораторий, не обладающих достаточной площадью теплиц. Выбор той или иной технологии (мини-, микроклубни, рассадный метод) определяется оснащенностью лаборатории и наличием площадей защищенного грунта.