Этапы клонального микроразмножения

Т. Мурасиге (1974) впервые предложил подразделить микроразмножение на три этапа:

1. Введение экспланта в культуру in vitro;

2.Собственно микроразмножение;

3. Укоренение и адаптация в нестерильных условиях.

Однако в последующем были предложены схемы клонального микроразмножения, более соответствующие выполняемым задачам на каждом этапе. П.К.Деберг, А.Г.Мэйн (1981) предложили выделить 5 этапов (стадий) клонального микроразмножения:

Этап 0. Подготовительная стадия. На этой стадии растительный материал подготавливается к культуре in vitro. Цель этапа состоит в получении стерильного стартового материала, находящегося в оптимальном для введения в культуру физиологическом состоянии;

Этап 1. Введение в культуру in vitro. Цель -обеспечить успешную пролиферацию экспланта в культуре in vitro. Размножение на этом этапе не является важным;

Этап 2. Собственно размножение. Единственная функция этой стадии- увеличить число побегов. Для этого индуцируются меристематические центры, которые развиваются в почки и /или побеги;

Этап 3. Удлинение побегов и укоренение. На этом этапе удлиняются побеги, индуцируются и развиваются корни;

Этап 4. Перенос в тепличные условия. Большинство видов требуют адаптации в условиях ex vitro;

Рассмотрим особенности клонального микроразмножения на каждом из его этапов.

Этап 0. Подготовительная стадия. Исходным материалом для введения в культуру обычно служат элитные растения, типичные для данного сорта, без признаков инфекции. Для подготовки таких растений к введению в культуру in vitro желательно уменьшить их инфицированность путем выращивания в условиях теплиц, а также изменить физиологический статус. В теплицах поддерживается высокая температура (около 25 0 С) и сравнительно низкая влажность (70%). Для уменьшения инфицированности растения поливают непосредственно под корень, исключая полив листьев. Минимальная длительность такого режима зависит от вида растений. Например, для фикуса и драцены достаточно 3 месяцев. На этом этапе проводится термотерапия для борьбы с вирусами. (см.3.2)

Важно изменить физиологическое состояние растения, обеспечив реювенилизацию растений, способность тканей экспланта к пролиферации. Для этой цели регулируют физические условия (свет, температура), а также используют регуляторы роста. Целесообразно поддержание оптимального фотопериода. Важным является и спектральный состав света. Например, установлено, что длинноволновый красный свет обеспечивал повышение числа побегов у петунии в три раза в сравнении с необработанными растениями.

Для некоторых растений необходима холодовая обработка при температуре 4-50 С с целью выведения из состояния покоя (лилии, гиацинт, древесные растения). Длительность такой обработки зависит от вида растений.

Для реювенилизации исходных растений используются также регуляторы роста путем инъекции в стебель, опрыскивания или выдерживания эксплантов в специальных растворах. Для этой цели чаще всего используют цитокинины (6- БАП), а также гибберелловую кислоту.

Этап 1. Введение в культуру in vitro. Целью этапа является инициация роста тканей экспланта in vitro.Эксплантом для микроразмножения обычно служат апикальные или боковые почки. Для некоторых растений (фикус, антуриум, глоксиния) используют кусочки листа, для герберы и фрезии - части цветка, Для получения свободных от вирусов растений используют апикальные меристемы. При выборе экспланта необходимо учитывать следующее.

1. Экспланты из надземной части растения менее инфицированы, чем из подземной;

2.Внутренние части растения менее инфицированы, чем внешние;

3. Чем меньше эксплант, тем меньше риск инфицирования;

4. Регенерационная способность экспланта обычно обратно пропорциональна возрасту экспланта и возрасту исходного растения;

5. Эксплант, взятый из верхушечной почки, часто находится в более молодом возрасте и регенерационная способность его выше;

6. На эффективность приживаемости и успешной пролиферации влияет время взятия экспланта. Экспланты, взятые в состоянии активного роста растения (весна - начало лета), приживаются более успешно в сравнении с эксплантами взятыми у растений, находящихся в состоянии покоя (осень- зима).

Стерилизация эксплантов описана нами ранее. В качестве питательной среды чаще всего используют среду Мурасиге и Скуга или ее модификации. Для древесных растений применяют среду WPM (woody plant medium).

Учитывая видовую и сортовую специфику, оптимизируют состав макро- и микроэлементов, витаминов, углеводов и регуляторов роста для каждого вида (сорта) растения на каждом этапе микроразмножения. В составе питательной среды обычно используют следующие регуляторы роста: цитокинины 6-БАП, кинетин, зеатин, 2-ір в концентрации 1-10 мг/л; ауксины - индолилуксусная, индолилмасляная или нафтилуксусная кислота в концентрации 0-1 мг/л. Для апикальных меристем наряду с цитокининами и ауксинами возможно использование гибберелловой кислоты (0-1 мг/л). Физические условия в культуральной комнате: температура 18-280 С, длина дня -16 часов.

Важной на этом этапе, в особенности для древесных растений является проблема полифенолов. При механической изоляции экспланта возникает стрессовая ситуация, в которой синтез полифенолов усиливается. В культуре in vitro полифенолы окисляются полифенолоксидазами. Продукты окисления ингибируют активность ферментов, вызывают потемнение ткани и среды, что может привести к гибели экспланта. Для борьбы с этим явлением можно использовать антиоксиданты путем добавления в состав питательной среды или обработки экспланта перед помещением на среду. В качестве антиоксидантов используют поливинилпирролидон, аскорбиновую кислоту, дитиотриэтол и др. Возможно добавление в состав среды активированного угля. Возможны и другие подходы к решению проблемы полифенолов: культивирование эксплантов в начальный период в темноте или при пониженной освещенности, снижение температуры, частая пересадка эксплантов на свежую питательную среду. Длительность первого этапа колеблется от 1 до 2 месяцев.