Методы контроля вирусной инфекции

Применение тех или иных методов оздоровления посадочного материала не гарантирует полной элиминации вирусов в растениях. В связи с этим в технологии производства оздоровленного материала обязательными являются контроль вирусной инфекции при клональном микроразмножении, а также меры по защите растений от повторного инфицирования, поскольку оздоровленный материал не приобретает устойчивости к вирусу. Наиболее часто для целей диагностики наличия вирусов в растительном материале используют методы электронной микроскопии, иммуноферментного анализа, а также растения-индикаторы, чувствительные к вирусу.

Метод электронной микроскопии. Принцип действия метода основан на использовании потока электронов, вытекающих из вольфрамовой нити (катод) по направлению к аноду. Эти процессы происходят в стальной вакуумной трубке, к которой подключается напряжение 60 000 В. Между катодом и анодом располагается экран, покрытый флуоресцирующим веществом. Если на пути электронов поставить какой-либо предмет, то на экране будет видна его тень. Вирусный препарат помещают на специальную коллодиевую пленку, прозрачную для электронов. Для большей контрастности производится напыление инертными металлами (золотом, платиной, хромом и др.). Изображение направляется, преломляется и фокусируется с помощью электромагнитных линз. Разрешающая способность электронного микроскопа -40-60 тысяч раз, что позволяет увидеть в поле зрения вирусную частицу.

С помощью этого метода можно определить относительную концентрацию вирусных частиц в соке или препарате и подсчитать их количество на единице площади листа или в единице массы исследуемой ткани. Достоинство электронной микроскопии как метода диагностики вирусов состоит в возможности использования небольшого количества сока или растительной ткани. Высокая чувствительность метода позволяет обнаруживать вирусы, находящиеся в растениях в невысокой концентрации. Метод показывает высокую достоверность выявления зараженности X,S, M,Y - вирусами картофеля. Метод обладает универсальностью. Недостаток метода - необходимость дорогостоящего и сложного оборудования.

Иммуноферментный анализ. Метод основан на взаимодействии антиген-антитело и количественном определении взаимодействовавших частиц. При введении в организм животных (кролики, мыши и др.) вирусов (антигены) иммунная система вырабатывает в крови животного специфические антитела - иммуноглобулины, способные соединяться с антигенами и нейтрализовать их действие. Антитела находятся в жидкой части крови - сыворотке, которая и используется для их получения. В качестве примера приведем наиболее распространенный вариант ИФА - «сэндвич-метод». Анализ проводят в специальных платах из полистирола, обладающих способностью адсорбции антител на своей поверхности. На первом этапе анализа в каждую из 96 ячеек платы вносят антитела, адсорбирующиеся в ячейках и способные удерживаться на поверхности после их промывки.

На втором этапе в ячейки вносится сок листьев анализируемых растений. При наличии в нем вирусов происходит взаимодействие антитело-антиген.

На третьем этапе в ячейки вносят меченые ферментом антитела (коньюгат), которые сохраняют активность фермента и иммунную активность. Коньюгат присоединяется к комплексу антитело-антиген.

На четвертом этапе добавляется субстрат - вещество, которое способно окисляться под действием фермента, окрашивая раствор в желто-коричневый цвет. Путем фотометрирования по оптической плотности определяют концентрацию вирусов.

Иммуноферментный анализ является высочувствительным и высопроизводительным методом качественной и количественной диагностики вирусов. К примеру, он позволяет проанализировать X, S, M, Y, F, L- вирусы картофеля. Не требует большого количества растительного материала, дает возможность диагностики пробирочных растений после оздоровления, а также органов растения в грунте (листья, клубни, ростки и т.д.).Применяется для диагностики вирусов картофеля, плодовых, ягодных растений.

Растения- индикаторы. Метод основан на чувствительности отдельных видов или сортов растений к определенным вирусам.Наблюдаются три типа реакций растений - индикаторов на вирусы: локальная - проявление некротических пятен на листьях в местах инфицирования; системная - мозаика, деформации листьев, некрозы различных органов; смешанная реакция - проявление симптомов вируса в местах инфицирования, а затем по всему растению (Блоцкая, 1989).

Инфекция переносится на индикатор механической инокуляцией сока с помощью насекомых - переносчиков или прививкой. Признаки заболевания проявляются при локальной реакции через 5-12 дней, при системной - через 15-30дней. С помощью индикаторов можно определить вирусы в материале с очень низкой концентрацией инфекционного начала. Помогает метод и при отсутствии других методов диагностики. Растения-индикаторы используются при анализе инфицированности картофеля, земляники и др.

К примеру, для анализа Х -вируса картофеля используются гомфрена Gomphrena globosa L, дурман обыкновенный Datura stramonium L, табак Nicotiana tabacum (сорт Samsun). Последний применяется также для определения У и А - вирусов. Для анализа М и S вирусов может использоваться томат чилийский Lycopersicon chilense. Индикаторный метод широко используется для диагностики вирусов У и А, диагностические сыворотки к которым не обладают достаточной эффективностью.

Таким образом, ни один из методов диагностики не обладает абсолютной точностью, и для изучения инфицированности растений желательно сочетание различных методов анализа.