Влияние концентрации субстрата на кинетику реакции

 

Во многих случаях условие постоянства концентрации субстрата не выполняется. С одной стороны, избыток субстрата не используется в реакции in vitro с некоторыми ферментами из-за часто происходящего ингибирования ферментативной активности субстрата. В этом случае можно применять только оптимальную его концентрацию, и это не всегда обеспечивает избыток субстрата, необходимый для выполнения кинетических уравнений обсуждаемых выше механизмов. Более того, в клетке in vivo избыток субстрата, необходимый для осуществления этого условия, обычно не достигается.

В ферментативных реакциях, где субстрат не находится в избытке и, следовательно, его концентрация меняется в ходе реакции, константа диссоциации фермент-субстратного комплекса равна

 

K_S = ([S] ₀ - [ES] - [P]) [E]_T - [ES])/[ES]

 

([S]₀ - концентрация субстрата при t = 0). В этом случае начальная скорость реакции (в стационарном состоянии) определяется формулой

 

v= V_max [S_t] / (K_m + [S_t])

 

где [S_t] - концентрация субстрата в момент времени.

Тем не менее, можно написать приблизительное решение для двух случаев, когда [S]_о = [S_t]:

) если это неравенство выполняется из-за больших значений t, т.е. когда более 5% от начальной концентрации субстрата израсходовалось за время реакции;

) если концентрацией фермента нельзя пренебречь по сравнению с концентрацией субстрата и, таким образом, нужно принимать во внимание концентрацию фермент-субстратного комплекса.

Если t велико, а концентрация [ES] пренебрежимо мала по сравнению с [S]₀, то уравнение константы диссоциации фермент-субстратного комплекса переходит в следующее:

K_S = ([S]₀ - [P]) ([E]_T - [ES]) / [ES]

 

Для значения концентрации [S_t], которая меняется в ходе реакции, удовлетворительным приближением служит значение ([S]₀ + [S_t])/2. Так как [S_t] = [S]₀ - [Р], среднюю скорость ; можно выразить как

 

 

Подставив это выражение и приблизительное значение [S_t] в

 

v= V_max [S_t] / (K_m + [S_t]),

 

получим:

 

 

При сравнении значений, рассчитанных на основе этого приближения, со значениями, полученными из точного, проинтегрированного уравнения Михаэлиса - Ментен, оказывается, что ошибка в определении K_mсоставляет 1 и 4% при расходовании 30 и 50% субстрата соответственно. Следовательно, ошибка при данном приближении незначительна по сравнению с ошибкой измерения.

Когда расход субстрата не превышает 5% начальной концентрации, но концентрация фермента так велика, что [ES] по сравнению с [S]₀ нельзя не учитывать, константа диссоциации фермент-субстратного комплекса равна:

 

K_s = ([S]₀ - [ES]) ([E]_T - [ES]) / [ES]

 

Его решение относительно [ES] дает

 

Из двух возможных решений может быть выбрано только отрицательное, так как только оно удовлетворяет начальным условиям: [ES] = 0 при [S]₀ = 0 или [Е]_T = 0. По аналогии с уравнением отношения v/V_max мы получили уравнение начальной скорости. Квадратное уравнение, полученное из уравнения константы диссоциации фермент-субстратного комплекса, найденную чуть выше, с помощью формул v = k₂ [ES] и V_max = k₂ [E]_T, можно привести к следующему виду:

 

[S]₀ V_max / v = K_s V_max / (V_max - v) + [E]_T

 

Если известно V_max можно рассчитать K_s.

Следует учесть два предельных случая. В первом случае [S]<<K_m.

 

v = (V_max / K_m) [S] = k[S]

 

Таким образом, мы получили кажущуюся реакцию первого порядка и k=V_max/K_m - кажущуюся кинетическую константу первого порядка. Ее фактическая размерность - время ^-1, но она является комбинацией констант скорости первого и второго порядков нескольких элементарных стадий, т.е. k₁k₂[E]_T/(k_-1 + k₂). При условиях кажущегося первого порядка kявляется мерой прохождения реакции.

Другой предельный случай: [S] >>K_m.Здесь константа K_mничтожно мала по сравнению с [S], и, таким образом, получаем v = V_max. [2]

 

Образование кинетически устойчивого комплекса фермент - продукт

 

Если в ходе реакции происходит образование кинетически устойчивого комплекса фермент - продукт, механизм реакции выглядит следующим образом:

 

 

Применив предположение о стационарном состоянии, можно написать дифференциальные уравнения:

 

d [ES] /dt = k₁ [E] [S] + k_-2 [EP] - (k_-1 + k₂) [ES] = 0[EP] /dt = k₂ [ES] - (k_-2 + k₃) [EP] = 0

 

Из этих уравнений следует, что

 

[ES] = [(k_-2 + k₃) / k₂] [EP]

[E] = [(k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃) / k₁k₂ [S]] [EP]

 

Так как                               v = k₃ [EP]

 

и                                  [E]_T = [E] + [ES] + [EP] =

= [(k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃) / k₁k₂ [S] + (k_-2 + k₃) / k₂ + 1] [EP] =

= {[k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃ + k₁ [S] (k_-2 + k₃) + k₁k₂ [S]] / k₁k₂ [S]} [EP]

 

получаем

 

[EP] = k₁k₂[S] [E]_T / [k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃ + k₁ [S] (k_-2 + k₃ + k₂)]= k₁k₂k₃[S] [E]_T / [k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃ + k₁ [S] (k_-2 + k₃ + k₂)] =

= [k₂k₃ / (k_-2 + k₃ + k₂)] [E]_T[S] / [(k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃) / k₁ (k_-2 + k₃ + k₂) + [S]]

 

То есть

 

V_max = [k₂k₃ / (k_-2 + k₃ + k₂)] [E]_Tm = (k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃) / k₁ (k_-2 + k₃ + k₂)

 

В этом случае уже очень сложно вычислить конкретные значения индивидуальных констант скорости, так как прямо измерить можно только их отношение. Ситуация еще более затрудняется при усложнении механизма ферментативной реакции, когда в реакции участвуют больше двух комплексов, потому что количество констант скорости в уравнении, естественно, гораздо больше, и их соотношения также сложнее. [2]

Однако ситуация упрощается, если после обратимой реакции образования первого комплекса последующие элементарные стадии необратимы. Важными представителями ферментов, подчиняющихся этому механизму, являются протеолитические ферменты и эстеразы. Механизм их реакции можно записать следующим образом:

 

 

где ES` - ацилферментное промежуточное соединение, которое разлагается под действием воды. Мы можем написать

 

d [P₂] /dt = d [P₁] / dt = v = k₁k₂k₃ [S] [E]₀ / [k₃(k_-1 + k₂) + [S] (k₂ + k₃)]

V_max = k₂k₃ [E]₀ / (k₂ + k₃) = k_кат [E]_0m = k₃ (k_-1 + k₂) / (k₂ + k₃) k_1кат / K_m = k₂k₁ / (k_-1 + k₂) = k₂ / K_m’

Константа Михаэлиса стадии ацилирования - K_m'  K_s. Чем больше отношение k_кат/K_m, тем выше специфичность субстрата. [5]

Определение констант значительно упрощается, если эксперимент проводят в присутствии нуклеофильного агента (N), способного конкурировать с водой. Тогда

 

 

 

k₃ = k₃’ [H₂O] и P_i (i = 1, 2, 3) - продукты.

v_i = k_{кат, i} [E₀] [S] / (K_m + [S])_{кат, 1} = k₂ (k₃ + k₄ [N]) / (k₂ + k₃ + k₄ [N])_{кат, 2} = k₂k₃ / (k₂ + k₃ + k₄ [N])_{кат, 3} = k₂k₄ [N] / (k₂ + k₃ + k₄ [N])_m = K_s (k₃ + k₄ [N]) / (k₂ + k₃ + k₄ [N])

/v_N = K_s (k₃ + k₄ [N]) / k₂k₃ [S] [E₀] + (k₂ + k₃ + k₄ [N]) / k₂k₃ [E₀]

 

Так как известно, что K_s/k₂ = K_m/ k_кат, и если нуклеофил отсутствует, то

 

1/v = K_s / k₂ [S] [E₀] + (k₂ + k₃) / k₂k₃ [E₀]

 

и для определения констант можно использовать точку пересечения прямых в координатах 1/v_N (и 1/v) - 1/[S]. Две прямые линии в двойных обратных координатах пересекаются во втором квадранте. В отсутствии нуклеофила точка пересечения прямой с вертикальной осью определяется как 1/V_max и 1/k_кат[E₀], а с горизонтальной осью - как -1/K_m. Координаты точки пересечения двух прямых: -1/K_s и 1/k₃[E₀]. Расстояние между 1/V_max и 1/k₃[E₀] равно 1/k₂[E₀].