Устройство к спектрофотометру

 

Устройство к спектрофотометр состоит из дозатора 1, вращающейся тефлоновой нити 2 (мешалка) и крышки-фиксатора 3.

Дозатор - это микропипетка, один конец которой оформляется иглой 4, второй - уширением 5 (для предотвращения попадания фермента в резиновый наконечник 6).

В тефлоновой крышке 3, закрывающей спектральную кювету 7, имеются два отверстия: одно (8) в центре крышки, второе (9) над серединой промежутка между непрозрачной стенкой кюветы 7 и лучом света 10. Тефлоновая трубка 11 (внутренний диаметр 1 -1,5 мм) одним концом закрепляется в отверстии 9, вторым - на неподвижном выступе 12 перед ротором мотора 13. Внутрь трубки вводится тефлоновая нить 2 (толщина нити 0,5-0,6 мм). Один конец нити укрепляется на вращающемся роторе мотора 13, второй - пропущенный в кювету 7 - оформляется в виде спирали (для усиления перемешивания). Положение нити определяет крышка-фиксатор 3 вне зависимости от удаления мотора, что удобно при работе, требующей частой смены кювет.

Принцип работы. Кварцевая кювета спектрофотометра 7 наполняется субстратом 14 (около 1,5-2,0 мл), вставляется в термостатический кюветодержатель спектрофотометра, закрывается крышкой 3 с вращающейся тефлоновой нитью 2, которая погружается в субстрат 14, и все дальнейшие операции выполняются уже в луче света спектрофотометра и регистрируются на самописце.

В начале работы осуществляется перемешивание субстрата, и перо самописца пишет ровную горизонтальную (или «нулевую») линию. Дозатор (с ферментом) вставляется в отверстие 8 (игла погружается в раствор субстрата 14), быстрым сдавливанием наконечника 6 фермент (обычно около 0,03-0,05 мл) вводится в субстрат, и дозатор удаляется. Перемешивание компонентов заканчивается за 2,5-3 с, и перо самописца фиксирует начало реакции отклонением кривой зависимости оптической плотности (ΔА) от времени.

Такое приспособление позволяет также отбирать пробы из реагирующей системы на анализ; вносить в систему добавки ингибиторов и активаторов; изменять условия протекания реакций (изменять рН, ионную силу и т.п.) без нарушения регистрации хода реакций, что оказывается очень удобным, например, при исследовании расщепления n -НФФ «кислыми» фосфатазами, где расщепление n -НФФ проводят при рН 5,0 (или рН 6-7), а активность ферментов определяют по накоплению n -нитрофенолят ионов при рН 9,5-10,0. [4]

Удобно такое устройство и для проведения спектрофотометрического титрования ферментов и т.п.

 

Устройство к рН-метру

 

Устройство к рН-метру состоит из модифицированного наконечника проточного электрода 1, полумикроячейки 2, дозатора 3 и электронной схемы подключения рН-метра к самописцу. Кроме того, устройство включает стандартный электрод рН-метра (4), крышку-держатель ячейки (5), термостатическую проточную камеру (6), раствор субстрата (7), пассивный магнит (8), активный магнит (9).

Стандартный наконечник проточного электрода рН-метра (ЛПУ-01) заменяется тефлоновой трубкой 1 (внутренний диаметр 1,3-1,5 мм), заполняется асбестовой нитью, предварительно обработанной насыщенным раствором KCl. Плотность заполнения нити регулируется таким образом, чтобы скорость протока раствора KCl через трубку была близкой к скорости протока исходного немодифицированного электрода. Такая замена наконечника дает возможность снизить размеры исходной рабочей ячейки с 20-25 до 2 мл, что позволяет обходиться минимальными объемами (1,5 мл) растворов дорогостоящих биохимических препаратов. [4]

Электронная схема подключения рН-метра (ЛПУ-01) к самописцу состоит из источника питания (батареи постоянного тока 12 В), переменного проволочного сопротивления R₁ (10 - 100 Ом), задающего по показанию вольтметра напряжение 9 В на стабилотроне Д809, переменного проволочного сопротивления R₂ (15-150 Ом), регулирующего установку «нуля» (начала отсчета) показаний рН-метра на шкале самописца, и переменного проволочного сопротивления R₃ (35-500 Ом), регулирующего масштаб расширения (усиления) показаний шкалы рН-метра на самописце. Схема работает надежно до падения напряжения источника не ниже 9 В.

Принцип работы. В ячейку (стеклянный цилиндр 1,7х2,4 см) вносится 1,5 мл субстрата, и ячейка закрепляется на крышке-фиксаторе 5. Включается перемешивание 9, и перо самописца пишет ровную (базисную) линию отсчета. При помощи дозатора 0,03 мл раствора фермента вносится в субстрат, и перо самописца фиксирует начало реакции отклонением кривой зависимости рН от времени (t).

Такое устройство не заменяет рН-стата, но с учетом возможности расширения шкалы рН-метра позволяет надежно фиксировать незначительные изменения рН 0,004-0,005.

 

3.3 Номограммные линейки, удобные для определения начальной скорости

 

Значительную трудоёмкость определений начальной скорости в методе касательных составляет подсчёт отношений изменения концентраций реагентов (Δ[S]) за единицу времени (Δt), т.е. выражение v₀ в М/мин из условий, что

 

v₀ = lim Δ[S] / Δt, при, t 0.

 

На практике такая процедура складывается обычно из трех-четырех отдельных операций: проводят касательную к начальному участку кривой хода реакции, затем подсчитывают число единиц регистрируемой величины (оптическая плотность, угол вращения и т.п.), приходящихся на определенный интервал времени, приводят это к единице времени и, наконец, делают пересчет показаний самописца на изменение концентраций реагента за 1 мин (М/мин). Предлагаемые два типа номограммной линейки позволяют упростить эту процедуру.

Прямоугольная линейка. v₀ есть отношение Δ[S]/Δt, т.е. tg ά, где ά - угол наклона касательной к оси времени t. Эта же касательная является и гипотенузой соответствующего прямоугольного треугольника с катетами [S] иt. Чем больше v₀, тем круче наклон касательной. Следовательно, если мы ограничимся определенным интервалом времени, например 1 мин, то получим серию прямоугольных треугольников с разной величиной катета [S] (в действительности разной величиной v₀). Если же проградуировать оба катета: горизонтальный - в единицах отсчета времени (1 мин), а вертикальный- в единицах изменения концентраций реагента, например в миллимолях (мМ), и нанести полученные отрезки на подходящий формат из прозрачного материала (оргстекло толщиной около 2 мм), то можно получить удобную линейку для определения начальных скоростей реакций. Все цифры и линии наносятся на обратной стороне линейки, чтобы исключить погрешности на параллакс при определениях v₀.

Процедура определения v₀ сокращается в этом случае до двух простых операций: к начальному участку кинетической кривой t проводят касательную 2 и совмещают нулевую точку горизонтального катета t линейки с началом касательной, продолжение касательной пересечет теперь шкалу концентраций [S] в точке, определяющей значение v₀ в М/мин (при горизонтальном положении катета t на. Никаких дополнительных операций больше не требуется. [4]

Дуговая линейка. Процедуру определения v₀ можно упростить до одной операции, если шкалу концентраций отложить по дуге определенного радиуса.

На пластинку из прозрачного материала наносят прямую («базисную») линию 2 (все цифры и линии также наносят на обратной стороне линейки) и из нулевой точки (t=0, мин) этой линии радиусом, равным длине катета t=1 мин [, проводят дугу [S], сверху вниз по которой откладывают шкалу изменения концентраций реагента (например, субстрата в мМ).

Процедура определения v₀ сводится в этом случае к одной операции. На кинетическую кривую 1 накладывают линейку так, чтобы ее «базисная» линия 2 к начальному участку кривой 1, а нулевая точка (0) этой базисной линии находилась на одной из горизонтальных линий 3 бумаги самописца. Продолжение этой горизонтальной линии в таком случае пересечет шкалу концентраций расщепляемого субстрата (дуга [S]) в точке, определяющей значение v₀ в М/мин. Никаких дополнительных операций и в данном случае больше не требуется. [4]

Описанные типы линеек, устройство к спектрофотометру и рН-метру в течение ряда лет используются для определения начальных скоростей реакций (v₀), при исследовании субстратной специфичности ферментов, для спектрофотометрического титрования и т.п.

 

Заключение

В данной работе был рассмотрен раздел энзимологии, изучающий зависимость скорости химических реакций, катализируемых ферментами, от ряда факторов окружающей среды. Основоположниками данной науки по праву считаются Михаэлис и Ментен, к оторые опубликовали свою теорию общего механизмаферментативных реакций, вывели уравнение, ставшее фундаментальным принципом всех кинетических исследований ферментов, оно служит отправной точкой при любом количественном описании действия ферментов. Исходное уравнение Михаэлиса - Ментен является уравнением гиперболы; свой вклад в кинетику внесли Лайнуивер и Бэрк, которые преобразовали уравнение Михаэлиса - Ментен и получили график прямой, по которой можно наиболее точно определить значение V_max.

С течением времени изменение скорости ферментативной реакции в ферментативной реакции в экспериментальных условиях уменьшается. Снижение скорости может происходить за счёт ряда факторов: уменьшение концентрации субстрата, увеличение концентрации продукта, который может оказывать ингибирующее действие, могут происходить изменения рН раствора, изменения температуры среды. Так при повышении температуры на каждые 10°С скорость реакции увеличивается в 2 раза и даже меньше. Низкая температура обратимо инактивирует ферменты. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН свидетельствует о состоянии функциональных групп активного центра фермента. Каждый фермент по-разному реагирует на изменение рН. Химические реакции можно останавливать путём действия на них различными видами ингибирования. Начальную скорость реакции можно быстро и точно определить при помощи таких приспособлений, как номограммные линейки, устройство к спектрофотометру и рН-метру. Это позволяет наиболее точно представить активность изучаемых ферментов.

Всё это активно используется в наши дни в медицинской практике.