Мазки - это предназначенные для бактериоскопии, изготовленные на предметных стёклах препараты, в которых клетки тканей и микроорганизмы расположены в один слой.

Этапы приготовления мазков:

1 этап - нанесение исследуемой культуры или материала, на предметное стекло;

2 этап - высушивание;

3 этап - фиксация;

4 этап - окрашивание.

1-й этап. Нанесение материала:

- из органов:

поверхность органа прижигают раскаленным шпателем и делают разрез стерильным скальпелем. С поверхности разреза берут материал пастеровской пипеткой или бактериологической петлей и тонким слоем наносят на предметное стекло.

Из ткани органов делают мазки-отпечатки. С этой целью стерильными ножницами (скальпелем) вырезают небольшой кусочек, берут его пинцетом и легким прикосновением к чистому и обезжиренному предметному стеклу делают несколько отпечатков.

- из гноя или мокроты:

пастеровской пипеткой или бактериологической петлей исследуемый материал наносят на предметное стекло, накрывают другим предметным стеклом, раздавливают и разводят в разные стороны, получая при этом два мазка.

- из крови:

на предметное стекло, ближе к одному из краев, наносят каплю крови. Шлифованным предметным стеклом под углом в 45^о делают скользящее движение, равномерно распределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла.

- из бактериальной культуры:

для приготовления мазков из культуры, выращенной на плотной питательной с реде, на обезжиренное предметное стекло бактериологической петлей, предварительно прокаленной докрасна (профламбированной), наносят небольшую каплю стерильного физ.раствора. Затем петлю фламбируют повторно, внося ее в пламя горелки в вертикальном положении, после чего из пробирки с культурой вынимают пробку мизинцем правой руки, обжигают край пробирки и вносят в нее бактериологическую петлю. Прежде чем взять небольшое количество культуры, петлю охлаждают, касаясь стенок пробирки. Петлю с культурой осторожно вынимают, еще раз обжигают края пробирки и закрывают ее пробкой, а культуру вносят в приготовленную ранее каплю физраствора, тщательно размешивают, равномерно распределяя по стеклу в виде небольшого круга или овала (1,5-2 см в диаметре). После окончания приготовления мазка петлю вновь прокаливают.

Для приготовления мазка из бульонной культуры бактериологической петлей наносят 1-2 капли исследуемого материала на поверхность предметного стекла и равномерно распределяют тонким слоем.

Й этап.

Приготовленные мазки высушивают на воздухе. Для ускорения высушивания стекло с мазком, обращенным вверх, держат в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, не допуская его перегревания.

Й этап.

Мазки фиксируют.

Методы фиксации мазков

Физический способ используют для фиксации мазков,приготовленных из бульонных или агаровых культур. С обратной стороны мазка карандашом по стеклу (стеклографом) или маркером обводят его границы и записывают шифр. Затем стекло с мазком, обращенным вверх, медленно проводят 3-4 раза над верхней частью пламени горелки, нагревая стекло не выше 60^оС. После этого материал плотно прикрепляется к стеклу и не смывается при дальнейшей обработке.

Химический способ используют для фиксации мазков из крови, мазков-отпечатков, и в некоторых случаях, мазков из патматериала, т.к. высокие температуры разрушают клеточные элементы. Для этих целей мазки погружают в фиксирующие жидкости:

- метиловый спирт – 5 минут;

- ацетон - 5 минут;

- этиловый спирт -10 минут;

- жидкость Никифорова (смесь спирта и эфира в равных объемах) – 15-20 минут.

Цель фиксации:

- закрепить микроорганизмы на стекле;

- убить и тем самым обезвредить микробные клетки;

- коагулировать белки микробных клеток, после чего они лучше воспринимают окраску.

Й этап.

Окрашивание мазков. При необходимости для окрашивания микроорганизмов используют различные методы.

Приготовление красящих растворов

В микробиологической практике для окрашивания микробов чаще всего применяют анилиновые красители. Различают краски основные, кислые и нейтральные. Микробы лучше окрашиваются основными красителями.

Наиболее часто используют:

фиолетовые – генциановый фиолетовый (генцианвиолет), метиловый фиолетовый (метилвиолет), кристаллический фиолетовый (кристаллвиолет).

красные – фуксин основной, фуксин кислый, нейтральный красный (нейтральрот), сафранин.

синие – метиленовый синий, водный синий.

зеленые – малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый.

Кроме перечисленных красок в бактериологии применяют сложные красители, представляющие собой нейтральную смесь. Примером такой сложной краски является краска Романовского-Гимза, в состав которой входят три красителя: азур, эозин и метиленовый синий, сохраняющие свое избирательное действие.

Все красители выпускают в виде аморфных или кристаллических порошков. Из них готовят насыщенные спиртовые, спиртово-водные и водные растворы красок. Для усиления действия в растворы красителей добавляют фенол, щелочи и подогревают мазки при окрашивании.

Для приготовления концентрированных спиртовых растворов красок в 10 см³ 96^о этилового спирта растворяют 1 г краски и помещают на сутки в термостат. Краски хранят в темных флаконах.

Приготовление растворов:

Карболовый (феноловый) генцианвиолет - к 10 см³ концентрированного раствора краски добавляют 90 см³ 2% водного раствора фенола. Сутки выдерживают в термостате, затем фильтруют.

Карболовый (феноловый) фуксин Циля – к 10 см³ концентрированногораствора краски основного фуксина добавляют 90 см³ 5% раствора фенола. Сутки выдерживают в термостате, затем фильтруют.

Водный фуксин Пфейфера – к 10 см³ фенолового фуксина Циля добавляют 90 см³ дистиллированной воды. Эта краска нестойкая и поэтому ее готовят каждый раз перед применением (ex temporо).

Метиленовый синий Леффлера – к 30 см³ спиртового раствора краски добавляют 100 см³ дистиллированной воды и 1 см³ 1% водного раствора КОН.

Водные растворы красок готовят на дистиллированной воде в концентрациях 0,5-5%, доводят их до кипения и фильтруют. Водные растворы красок нестойки, поэтому их не следует готовить впрок.

Для окраски по Граму используют раствор Люголя – 1 г кристаллического йода + 2 г йодистого калия растворяют в 300 см³ дистиллированной воды.

Морфология микроорганизмов

Основными морфологическими признаками микробов являются – форма, величина, подвижность, расположение в мазке, особенности внутренней структуры (наличие спор, капсул, биполярности).

I. Форма микроорганизмов.

Кокки могут быть сферической, овальной, бобовидной формы. Для различных видов кокков характерно своеобразное расположение клеток, связанное со способом деления:

микрококки – (от лат. «micros» - маленький) расположены беспорядочно. В диаметре не превышают 0,5 мкм ( например, Micrococcus luteus);

диплококки – (от греч. «diploоs» - двойной) располагаются попарно (например, Streptococcus pneumoniae) делятся в одной плоскости;

стрептококки - (от греч. «streptos» - цепочки) – располагаются в виде цепочек различной длины (например, Streptococcus equi), деление происходит в одной плоскости и образующиеся клетки не разъединяются;

тетракокки – (от греч. «tetra» - четыре) располагаются по четыре, деление происходит в двух взаимно перпендикулярных плоскостях ( например, Aеrococcus viridans);

стафилококки – (от греч. «staphyle» - гроздь винограда) образуют беспорядочное скопление клеток, напоминающие гроздь, делятся в различных направлениях без особой закономерности (например, Staph. aureus);

сарцины - (от лат. «sarcio» - связываю) кокки, располагающиеся объемными пакетами по 8, (например, Sarcina ureae). Деление происходит в 3-х взаимоперпендикулярных плоскостях (Рис. 4).

Рис. 4 (По Ереминой В.А., 1998). Взаимные расположения кокков:
а - микрококки; б - диплококки;