У сеголетков; 2 - у карпов старшего возраста.

У сеголетков; 2 - у карпов старшего возраста.

Правила фиксации мелких рыб (мальки и сеголетки) после вскрытия брюшной полости фиксируют целиком, а от крупных берут органы или кусочки органов размером 2х3 см и толщиной 0,5-1,0 см. Независимо от степени поражения берут кусочки из различных органов, фиксируют 40%-ным водным раствором глицерина, солевым раствором и кусочками льда.

3. Отбор проб воды из больших водоемов производится в нескольких местах. Пробы, берут на глубине 10-15 см от поверхности и не менее 10-15 см от дна.

Способы отбора проб воды могут быть различными, но обязательным условием является соблюдение асептики и взятие материала в стерильную посуду. Пробы воды в количестве 500 мл отбирают в стерильную посуду с притертой пробкой. Наполняют флаконы с таким расчетом, чтобы при транспортировке не замочить пробку. Посуду и батометры стерилизуют, завернутыми в бумагу и разворачивают их непосредственно перед взятием проб воды.

Пробы воды исследуют не позднее, чем через 2 ч после отбора. При невозможности выполнения этих условий допускается проведение анализа не позднее, чем через 24 ч после отбора проб, сохраняя их при температуре от 1 до 5°С. Посуду с пробами упаковывают в сумки--холодильники.

Отобранные пробы сопровождаются документом, содержащим следующие сведения:

- точное месторасположение водоема;

- дату отбора;

- количество отобранных проб и место их отбора;

- цель исследования: сделан ли отбор в порядке текущего санитарного надзора или по особым показаниям (сигналы об эпизоотологическом неблагополучии и т.д.);

4. Грунт для исследования берут в количестве 2 кг с поверхности дна водоема дночерпателем Экмана и Кирпичникова, соблюдая правила асептики (Рис.2). На исследуемый материал по специальной форме составляют сопроводительный документ и посылают в лабораторию с нарочным. Обследуют до и после проведения оздоровительных мероприятий в частности дезинфекции и др.

Пробы отбирают выше предпологаемого источника загрязнения, в месте поступления сточных вод и на различном расстоянии в нескольких точках ниже места выпусков стоков на течении и в застойных зонах(ямах,низинах). Грунт высушивают на воздухе, растирают в ступке, просеивают через мелкое сито и упаковывают в банки или полиэтиленовые мешочки по 50 гр.

5. Планктон собирают планктонной сеткой, фильтруя такое количество воды, которое необходимо для получения около 50 г живой массы планктона.

Материал для исследования отправляют комиссионно, весь материал (пробы воды, грунта, планктона и рыб) упаковывают в водонепроницаемую тару, составляют акт и сопроводительный документ и отправляют в лабораторию с нарочным.

Рис. 2. Приспособления для взятия проб грунта и планктона:
Л — скребок; Б — дночерпатель; В — планктонная сетка.

Методы диагностики инфекционных болезней рыб

Диагноз на инфекционные болезни ставят комплексно, учитывая эпизоотологические данные, клинические признаки, патологические изменения в органах и тканях и результаты лабораторных исследований.

Рис. 3. Метод «висячей капли».

Прижизненная окраска микробов

Для изучения морфологических особенностей микробов проводят их прижизненную окраску, с целью определения подвижности, характера деления, реакции на химические вещества и т.п.

Живые микробы мало восприимчивы к красителям, окрашиваются только погибшие клетки.

При микроскопических исследованиях для прижизненной окраски микробов используют:

Метод Фиккерта:

На предметное стекло наносят каплю бульонной культуры, в которую вносят каплю нейтральрота перемешивают и накрывают покровным стеклом так, чтобы жидкость доходила до края покровного стекла.

Микроскопируют немедленно под увеличением объектива х40. Кроме выявления формы микроба определяют его подвижность.

Метод Наканиши:

1. На предметное стекло наносят каплю горячего 0,001% раствора метиленового синего и высушивают в термостате.

2. Салфеткой тщательно растирают каплю по поверхности стекла до бледно-голубого цвета.

3. На окрашенном стекле готовят препарат «раздавленная капля»
(см. определение подвижности у микробов).

4. Краска растворяется, и микробы окрашиваются сначала в голубой, а потом в синий цвет.

Для более детального изучения морфологии микроорганизмов, их тинкториальных свойств готовят фиксированные, окрашенные преараты на предметных стёклах.

Рис. 9. Клетка Salmonella typhimurium в состоянии покоя (А) и при движении (Б) Стрелками показано направление вращения и движения клетки.

Рис. 10. Клетка спирохеты в продольном (А) и поперечном (Б) разрезе.

 

В зависимости от фактора различают хемотаксис (частный случай - аэротаксис), фототаксис, магнитотаксис, термотаксис и вискозитаксис.

 

Наибольшее внимание привлекает изучение хемотаксиса, т. е. движения в определенном направлении относительно источника химического вещества. Для каждого организма все химические вещества в этом плане могут быть разделены на две группы: инертные и вызывающие таксисы (эффекторы). Среди последних выделяют аттрактанты (вещества, привлекающие бактерий) и репелленты (вещества, отпугивающие бактерий).

Аттрактантами могут быть сахара, аминокислоты, витамины, нуклеотиды и другие химические молекулы; репеллентами - некоторые аминокислоты, спирты, фенолы, неорганические ионы. Аттрактантом для аэробных и репеллентом для энаэробных прокариот является молекулярный кислород. Аттрактанты часто представлены пищевыми субстратами, хотя не все вещества, необходимые для организма, выступают в качестве аттрактантов. Также не все ядовитые вещества служат репеллентами и не все репелленты вредны.

Фототаксис, т. е. движение к свету или от него, свойствен, прежде всего, фототрофным бактериям. Способность перемещаться по силовым линиям магнитного поля Земли или магнита - магнитотаксис - обнаружен у разных бактерий, обитающих в пресной и морской воде. В клетках этих бактерий найдены непрозрачные частицы определенной геометрической формы - магнитосомы, заполненные железом в форме магнетита (Fe₃O₄) и выполняющие функцию магнитной стрелки.

На долю магнетита может приходиться до 4 % сухого вещества бактерий. В северном полушарии такие магниточувствительные бактерии плывут в направлении северного полюса Земли, в южном - в направлении южного. У ряда бактерий обнаружен вискозитаксис - способность реагировать на изменение вязкости раствора и перемещаться в направлении ее увеличения или уменьшения.

За чувствительность бактерий к градиентам определенных факторов ответственны специфические рецепторы. Изучение хемотаксиса у Escherichia coli позволило обнаружить свыше 30 различных хеморецепторов, представляющих собой белки, синтезируемые независимо от присутствия индуктора или только в результате индукции. Рецептор реагирует на эффектор и передает сигнал по определенному пути, конкретный механизм которого неизвестен, на "мотор" жгутика. У бактерий с перитрихиальным жгутикованием выявлены два вида двигательного поведения: прямолинейное движение и кувырканье, т. е. периодические и случайные изменения направления движения. Если бактерия перемещается в сторону оптимальной концентрации аттрактанта, ее прямолинейное движение, ориентированное по отношению к химическому веществу, становится более длительным, а частота кувырканий более низкой, что позволяет ей в конечном итоге перемещаться в нужном направлении.

Задания для самостоятельной работы:

1. Отработать методику изготовления мазков.

2. Контрольные вопросы:

1. Число и расположение жгутиков у разных бактерий

2. Механизмы движения. Таксис.

ТЕМА№3

Изучение микроорганизмов в окрашенных,
фиксированных мазках

Й этап.

Приготовленные мазки высушивают на воздухе. Для ускорения высушивания стекло с мазком, обращенным вверх, держат в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, не допуская его перегревания.

Й этап.

Мазки фиксируют.

Методы фиксации мазков

Физический способ используют для фиксации мазков,приготовленных из бульонных или агаровых культур. С обратной стороны мазка карандашом по стеклу (стеклографом) или маркером обводят его границы и записывают шифр. Затем стекло с мазком, обращенным вверх, медленно проводят 3-4 раза над верхней частью пламени горелки, нагревая стекло не выше 60^оС. После этого материал плотно прикрепляется к стеклу и не смывается при дальнейшей обработке.

Химический способ используют для фиксации мазков из крови, мазков-отпечатков, и в некоторых случаях, мазков из патматериала, т.к. высокие температуры разрушают клеточные элементы. Для этих целей мазки погружают в фиксирующие жидкости:

- метиловый спирт – 5 минут;

- ацетон - 5 минут;

- этиловый спирт -10 минут;

- жидкость Никифорова (смесь спирта и эфира в равных объемах) – 15-20 минут.

Цель фиксации:

- закрепить микроорганизмы на стекле;

- убить и тем самым обезвредить микробные клетки;

- коагулировать белки микробных клеток, после чего они лучше воспринимают окраску.

Й этап.

Окрашивание мазков. При необходимости для окрашивания микроорганизмов используют различные методы.

Приготовление красящих растворов

В микробиологической практике для окрашивания микробов чаще всего применяют анилиновые красители. Различают краски основные, кислые и нейтральные. Микробы лучше окрашиваются основными красителями.

Наиболее часто используют:

фиолетовые – генциановый фиолетовый (генцианвиолет), метиловый фиолетовый (метилвиолет), кристаллический фиолетовый (кристаллвиолет).

красные – фуксин основной, фуксин кислый, нейтральный красный (нейтральрот), сафранин.

синие – метиленовый синий, водный синий.

зеленые – малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый.

Кроме перечисленных красок в бактериологии применяют сложные красители, представляющие собой нейтральную смесь. Примером такой сложной краски является краска Романовского-Гимза, в состав которой входят три красителя: азур, эозин и метиленовый синий, сохраняющие свое избирательное действие.

Все красители выпускают в виде аморфных или кристаллических порошков. Из них готовят насыщенные спиртовые, спиртово-водные и водные растворы красок. Для усиления действия в растворы красителей добавляют фенол, щелочи и подогревают мазки при окрашивании.

Для приготовления концентрированных спиртовых растворов красок в 10 см³ 96^о этилового спирта растворяют 1 г краски и помещают на сутки в термостат. Краски хранят в темных флаконах.

Приготовление растворов:

Карболовый (феноловый) генцианвиолет - к 10 см³ концентрированного раствора краски добавляют 90 см³ 2% водного раствора фенола. Сутки выдерживают в термостате, затем фильтруют.

Карболовый (феноловый) фуксин Циля – к 10 см³ концентрированногораствора краски основного фуксина добавляют 90 см³ 5% раствора фенола. Сутки выдерживают в термостате, затем фильтруют.

Водный фуксин Пфейфера – к 10 см³ фенолового фуксина Циля добавляют 90 см³ дистиллированной воды. Эта краска нестойкая и поэтому ее готовят каждый раз перед применением (ex temporо).

Метиленовый синий Леффлера – к 30 см³ спиртового раствора краски добавляют 100 см³ дистиллированной воды и 1 см³ 1% водного раствора КОН.

Водные растворы красок готовят на дистиллированной воде в концентрациях 0,5-5%, доводят их до кипения и фильтруют. Водные растворы красок нестойки, поэтому их не следует готовить впрок.

Для окраски по Граму используют раствор Люголя – 1 г кристаллического йода + 2 г йодистого калия растворяют в 300 см³ дистиллированной воды.

Морфология микроорганизмов

Основными морфологическими признаками микробов являются – форма, величина, подвижность, расположение в мазке, особенности внутренней структуры (наличие спор, капсул, биполярности).

I. Форма микроорганизмов.

Кокки могут быть сферической, овальной, бобовидной формы. Для различных видов кокков характерно своеобразное расположение клеток, связанное со способом деления:

микрококки – (от лат. «micros» - маленький) расположены беспорядочно. В диаметре не превышают 0,5 мкм ( например, Micrococcus luteus);

диплококки – (от греч. «diploоs» - двойной) располагаются попарно (например, Streptococcus pneumoniae) делятся в одной плоскости;

стрептококки - (от греч. «streptos» - цепочки) – располагаются в виде цепочек различной длины (например, Streptococcus equi), деление происходит в одной плоскости и образующиеся клетки не разъединяются;

тетракокки – (от греч. «tetra» - четыре) располагаются по четыре, деление происходит в двух взаимно перпендикулярных плоскостях ( например, Aеrococcus viridans);

стафилококки – (от греч. «staphyle» - гроздь винограда) образуют беспорядочное скопление клеток, напоминающие гроздь, делятся в различных направлениях без особой закономерности (например, Staph. aureus);

сарцины - (от лат. «sarcio» - связываю) кокки, располагающиеся объемными пакетами по 8, (например, Sarcina ureae). Деление происходит в 3-х взаимоперпендикулярных плоскостях (Рис. 4).

Рис. 4 (По Ереминой В.А., 1998). Взаимные расположения кокков:
а - микрококки; б - диплококки;

Многоклеточные бактерии

Многоклеточный организм должен отвечать следующим условиям:

его клетки должны быть агрегированы, между клетками должно осуществляться разделение функций, между агрегированными клетками должны устанавливаться устойчивые специфические контакты.

Многоклеточность у прокариот известна, наиболее высокоорганизованные многоклеточные организмы принадлежат к группам цианобактерий и актиномицетов. У нитчатых цианобактерий описаны структуры в клеточной стенке, обеспечивающие контакт двух соседних клеток — микроплазмодесмы. Доказана возможность обмена между клетками веществом (красителем) и энергией (электрической составляющей трансмембранного потенциала). Некоторые из нитчатых цианобактерий содержат помимо обычных вегетативных клеток функционально дифференцированные: акинеты и гетероцисты. Гетероцисты осуществляют фиксацию азота и интенсивно обмениваются метаболитами с вегетативными клетками.

Метод окраски по Граму

1) на фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги, на которую наносят раствор карболового генцианвиолета на 2 минуты;

2) пинцетом удаляют бумагу, краску сливают и не промывают водой;

3) наносят раствор Люголя на 2 минуты;

4) сливают раствор Люголя;

5) наносят йодированный спирт на 2 мин. (или 96^о этиловый спирт 30 сек.);

6) промывают мазок водой;

7) докрашивают фуксином Пфейфера 2 минуты;

8) краску сливают, мазок промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией.

Сущность метода окраски по Граму состоит в том, что отношение к краскам зависит от химического состава и структурных особенностей клеточной стенки микробной клетки, в частности наличия муреина (пептидогликана) и частично липидов. Грамположительные бактерии прочно удерживают комплекс краски генцианвиолета с йодом (раствором Люголя). Обработка бактерий спиртом вызывает разбухание муреина и уменьшает диаметр пор клеточной стенки, в результате краситель оказывается как бы «запертым» и воздействие второго красителя не дает видимых результатов. Поэтому грамположительные микроорганизмы, имеющие большое содержание муреина окрашиваются в фиолетовый цвет.

У грамотрицательных микроорганизмов слой муреина тонкий и не оказывает существенного влияния на проницаемость клеточной стенки; кроме того, они содержат большое количество липидов, которые хорошо растворяются в спирте и способствуют обесцвечиванию микробных клеток, поэтому они окрашиваются в красный цвет.

Модификация метода Грама по Синёву. В настоящее время широкое применение в практике бактериологических исследований нашел видоизмененный способ окраски по Граму, предложенный Синёвым. Раствор основного красителя заменяют фильтровальной бумагой пропитанной 1% спиртовым раствором кристаллвиолета. На препарат помещают окрашенную бумагу и наносят на нее 2-3 капли воды. Окрашивание идет в течение 2 минут, затем бумагу удаляют пинцетом и дальнейшую окраску препарата ведут общепринятым методом.

Фуксин Пфейфера можно заменить аналогично изготовленной красящей фильтровальной бумагой.

Окраска кислото-спирто-щелочеустойчивых микроорганизмов

В природе существует группа микроорганизмов, устойчивых к действию кислот, щелочей и спиртов; они относятся к роду Мyсobacterium. Среди них встречаются непатогенные (обитающая в сене и впервые обнаруженная в трафе-тимофеевке палочка тимофеевой травы, смегмозная палочка и др.), которые обнаруживают в масле, молоке, кормах, сперме, содержимом кишечника. К патогенным микобактериям относят возбудителей туберкулеза человека и животных (Myсobacterium tuberculosis), возбудителя паратуберкулезного энтерита крупного рогатого скота (Мyсobacterium paratuberculosis), возбудителя проказы (лепры) у человека (Мyсobacterium leprae).

У рыб болезни, вызываемые микобактериями, называются микобактериозы. Болезнь поражает самых различных рыб. Болезнь чаще протекает хронически, реже в острой форме, когда во внутренних органах обнаруживаются массовые скопления возбудителя. Заражение проходит при заглатывании бактерий с водой, у лососевых при поедании заболевших и погибших рыб. Установлено, что у живородящих тропических рыб наблюдается трансовариальный путь заражения- через зародышей, в которых развивается бактерия. В отношении рыб, мечущих икру, этот путь не доказан.

После обнаружения у рыб микобактерий в литературе высказывались предположения по поводу возможности распространения рыбами туберкулеза человека. Исследования последних лет показали несостоятельность этого предложения, однако было установлено, что при некоторых условиях микобактерии пойкилотермных животных могут сохраняться у теплокровных, и наоборот.возбудителем тубекулеза человека и теплокровных животных являются бактерии, относящиеся к тому же роду Мyсobacterium.

Клинические признаки не очень характерны. Заболевшие рыбы теряют аппетит, теряют в весе, окраска тела становится бледнее, наблюдаются дефекты чешуи и иногда появляютя язвы, разрушение плавников, пучеглазие и выпадание глазного яблока. У лососевых отмечены более яркая окраска тела и недоразвитие вторично-половых признаков.

При вскрытии рыб в печени, реже в почках и селезенке, обнаруживаются так называемые псевдоцисты в виде сероватых узелков, очень напоминающие капсулу гриба Ichthyosporidium. Псевдоцисты содержат скопление лейкоцитов, фагоцитировавших бактерий, а также самих бактерий. При остром течении болезни микобактерии выявляются на нативных и окрашенных мазках крови, взятой из внутренних органов. В некоторых случаях наблюдается скопление экссудата в плавательном пузыре и полости тела.

Диагноз ставится комплексно, учитывая клиничерезультаты ские данные, патологоанатомического вскрытия и подтверждается лабораторными методами. Особенно тщательно микобактериозы должны быть отдифференцированы от ихтиоспоридиоза. Дифференциальный диагноз может быть поставлен по наличию или отсутствию в псевдоцистах микобактерий..

В качестве возбудителей зарегистрированы многочисленные виды рода Мyсobacterium, однако в 9-ом издании Берджи оставлены 2 вида: Мyсobacterium marinum, Мyсobacterium fortuitum. Все остальные рассматриваются как синонимы.

Изучение микобактерий представляет интерес и с эпидемиологической точки зрения, так как доказано, что Мyсobacterium marinum может вызывать инфекцию у теплокровных животных и человека. На коже людей на месте внедрения появляются локальные эритемодермальные папулы. Входными воротами служат различные ссадины,раны. Особую опастность представляет рыбоводам,владельцам декоративных аквариумов и потребителей.

Все они палочковидные бактерии, грамположительные, неподвижные. Характерной особенностью является сильно выраженная кислотоустойчивость.

Кислотоустойчивость объясняется особым химическим составом микробных клеток, в частности, высоким содержанием жировоскоподобных веществ и наличием миколовой кислоты. Эти микробы с трудом воспринимают красящие растворы. Поэтому применяют красители с протравителями и нагреванием мазка над пламенем. Окрасившись, они прочно удерживают первую краску и не обесцвечиваются при кратковременном воздействии кислоты или спирта.

у сеголетков; 2 - у карпов старшего возраста.

Правила фиксации мелких рыб (мальки и сеголетки) после вскрытия брюшной полости фиксируют целиком, а от крупных берут органы или кусочки органов размером 2х3 см и толщиной 0,5-1,0 см. Независимо от степени поражения берут кусочки из различных органов, фиксируют 40%-ным водным раствором глицерина, солевым раствором и кусочками льда.

3. Отбор проб воды из больших водоемов производится в нескольких местах. Пробы, берут на глубине 10-15 см от поверхности и не менее 10-15 см от дна.

Способы отбора проб воды могут быть различными, но обязательным условием является соблюдение асептики и взятие материала в стерильную посуду. Пробы воды в количестве 500 мл отбирают в стерильную посуду с притертой пробкой. Наполняют флаконы с таким расчетом, чтобы при транспортировке не замочить пробку. Посуду и батометры стерилизуют, завернутыми в бумагу и разворачивают их непосредственно перед взятием проб воды.

Пробы воды исследуют не позднее, чем через 2 ч после отбора. При невозможности выполнения этих условий допускается проведение анализа не позднее, чем через 24 ч после отбора проб, сохраняя их при температуре от 1 до 5°С. Посуду с пробами упаковывают в сумки--холодильники.

Отобранные пробы сопровождаются документом, содержащим следующие сведения:

- точное месторасположение водоема;

- дату отбора;

- количество отобранных проб и место их отбора;

- цель исследования: сделан ли отбор в порядке текущего санитарного надзора или по особым показаниям (сигналы об эпизоотологическом неблагополучии и т.д.);

4. Грунт для исследования берут в количестве 2 кг с поверхности дна водоема дночерпателем Экмана и Кирпичникова, соблюдая правила асептики (Рис.2). На исследуемый материал по специальной форме составляют сопроводительный документ и посылают в лабораторию с нарочным. Обследуют до и после проведения оздоровительных мероприятий в частности дезинфекции и др.

Пробы отбирают выше предпологаемого источника загрязнения, в месте поступления сточных вод и на различном расстоянии в нескольких точках ниже места выпусков стоков на течении и в застойных зонах(ямах,низинах). Грунт высушивают на воздухе, растирают в ступке, просеивают через мелкое сито и упаковывают в банки или полиэтиленовые мешочки по 50 гр.

5. Планктон собирают планктонной сеткой, фильтруя такое количество воды, которое необходимо для получения около 50 г живой массы планктона.

Материал для исследования отправляют комиссионно, весь материал (пробы воды, грунта, планктона и рыб) упаковывают в водонепроницаемую тару, составляют акт и сопроводительный документ и отправляют в лабораторию с нарочным.

Рис. 2. Приспособления для взятия проб грунта и планктона:
Л — скребок; Б — дночерпатель; В — планктонная сетка.

Методы диагностики инфекционных болезней рыб

Диагноз на инфекционные болезни ставят комплексно, учитывая эпизоотологические данные, клинические признаки, патологические изменения в органах и тканях и результаты лабораторных исследований.