Общая характеристика явления

Конъюгацией у бактерий называют однонаправленную передачу генетической информации в результате непосредственного контакта между донорной и реципиентной клетками, т.е. фактически полового процесса. Таким способом обмен ДНК происходит не только между различными видами бактерий, но и между прокариотами и эукариотами. Поэтому конъю-гационный перенос ДНК считается основным типом обмена генетической информацией в природе.

Открытие бактериальной конъюгации Ледербергом и Татумом в 1946 году стало одним из краеугольных камней генетики бактерий. Данные авторы впервые установили, что для проявления конъюгации необходим непосредственный контакт между бактериальными клетками. Позднее это было подтверждено с помощью электронной микроскопии.

В 1953 году Хэйес установил, что обмен генетической информацией

у бактерий происходит только в одном направлении. Именно ему принадлежит честь открытия полового фактора Р. Исследованные данным автором штаммы кишечной палочки первоначально распались на 2 группы. В первой группе конъюгации не было. Во второй группе она происходила, но число рекомбинантов было небольшим. Представители разных групп вступали в конъюгацию в 100-1000 раз чаще. Их стали рассматривать в качестве разных половых типов - Р~ и Р⁺. Скрещивания бактерий штаммов Р~ х Р~ всегда безуспешны, а Р⁺ х Р⁺ лишь изредко дают рекомбинацию. Клетки Р~ после конъюгации приобретают характеристики Р⁺.

Позже был выделен и третий половой тип, определяющий высокую частоту рекомбинации - нет. Клетки этого типа возникают в культурах Р⁺. Скрещивания Р~ х Ни¹ дают особенно высокую частоту выхода рекомби­нантов — 1 на 10 исходных клеток (в скрещиваниях Р~ х Р⁺ - 1 на 10 исход­ных клеток).

Материальной основой всех вышеуказанных явлений является крупная плазмида - Р. Это кольцевая молекула ДНК длиной около 100 т.п.н., реплицирующаяся в клетке автономно от хромосомы. В ней идентифи­цировано около 20 генов, контролирующих различные этапы конъюгации. Большая часть этих генов образует единый репликон 1га длиной около 30 т.п.н.

Р~ штамм кишечной палочки не несёт Р-плазмиды, но может принимать её от донора. Такие штаммы называют реципиентными или женс­кими. В мужской клетке Р-плазмида может находиться в двух альтер­нативных состояниях: в автономном, когда она реплицируется независимо (Р⁺ штамм), и в интегрированном, когда она присоединяется к хромосомной ДНК и реплицируется в её составе как локус хромосомы (Н&-штамм). Частота интегрирования Р-плазмиды в хромосому клетки - хозяина составля­ет 1 на 10^б клеток Р⁺. В хромосоме кишечной палочки имеется более 20 сай­тов, в которых может происходить интеграция плазмиды Р и этот процесс опосредован особыми последовательностями ДНК - 18-элементами.

Наиболее важное отличие клеток Ни" от клеток Р⁺ заключается в способности первых осуществлять высокочастотный ориентированный перенос хромосомы. Клетки Р⁺ такой способностью не обладают. Следующее различие между клетками Н& и Р⁺ состоит в их разной способности и манере передавать клеткам-реципиентам плазмиду Р. Клетки Р⁺ передают плазмиду Р в виде цельной структуры. Клетки Н& передают плазмиду Р в «разорван­ном» состоянии в составе бактериальной хромосомы.

2 Механизм конъюгации у грамотрицательных бактерий Процесс конъюгации состоит из ряда последовательных стадий:

1 Столкновение клеток - начальный этап, наступающий после смешивания клеток-доноров и клеток-реципиентов. Возможность столкно­вения между клетками-донорами и клетками-реципиентами определяется плотностью смешиваемых клеток. Чем больше плотность смешиваемых клеток, тем больше количество сформированных конъюгационных пар. В экспериментальных условиях при постановке кроссов между донорными и реципиентными клетками используются суспензии, содержащие 1 млрд живых микробов в 1 мл.

2 Установление эффективных контактов после столкновения. Контакты между конъюгирующими клетками устанавливаются с помощью имеющихся у клеток-доноров специфических пилей. Соединение между клеткой-донором и клеткой-реципиентом происходит в результате взаимо­действия между концом пили и поверхностью клетки-реципиента. Установлено, что последние обладают специфическими рецепторными сайта­ми, которые взаимодействуют только с концом пилей. Подобные рецеп-торные места отсутствуют у клеток-доноров. Между двумя спаренными клетками образуется конъюгационная трубка.

3 Перенос ДНК от донора к реципиенту. Эта стадия процесса конъюгации может осуществляться двумя различными механизмами. Рассмотрим сначала механизм передачи плазмиды Р, а также практически

всех остальных конъюгативных плазмид, имеющих 1га-оперон и находя­щихся в клетке в автономном состоянии.

Начало конъюгационного переноса плазмиды Р связано с разрезанием одной из нитей ДНК плазмиды в локусе опТ, вследствие чего 1га-область плазмиды переносится в реципиентную клетку последней. Далее с помощью фермента ДНК-геликазы, кодируемого плазмидным геном, происходит раскручивание дуплекса ДНК. Освободившийся в результате надрезания и раскручивания конец одной из цепей ДНК переносится через конъюгационнуй пору (трубку) в клетку реципиента. Одновременно эта ДНК реплицируется.

В другой ситуации, когда плазмида Р находится в интегрированном состоянии (Н&-состояние), механизм передачи ДНК от донора к реципиенту значительно сложнее. Основное отличие данного механизма от рассмот­ренного выше заключается в том, что происходит не только передача собственно плазмиды Р, но и мобилизация ею переноса всей бактериальной хромосомы.

В процессе переноса в реципиентные клетки передается двухцепочечная ДНК, в которой одна нить синтезируется непосредственно во время передачи (это так называемая «транспортная репликация»). Этот процесс контролируется плазмидными генами. Разрыв хромосомы происходит в участке, находящемся в структуре плазмиды Р. Во время переноса хромосомной ДНК часть ДНК плазмиды образует ведущий конец передаваемой хромосомы, а основная часть плазмиды, включающая 1га-оперон, передается с концевым или дистальным участком хромосомы.

За 1 минуту передается примерно 40 тпн., т.е. около 1 % бактери­альной хромосомы, и, следовательно, перенос всей хромосомы из донорной клетки в клетку реципиента занимает примерно 100 минут.

Процесс конъюгации используется для генетического картирования. Генетический материал переносится от донора к реципиенту однонаправлено в строгой последовательности. Если резко (в специальном аппарате - блен-

дере) всряхнуть культуры клеток, вступивших в конъюгацию, то они разъединяются. В зависимости от продолжительности конъюгации до встряхивания в Р" клетку будет перенесена большая или меньшая часть хромосомы Ни*. Анализ полученных в том и другом случаях рекомбинантов позволяет определить порядок расположения генов в хромосоме. На карту кишечной палочки с помощью конъюгации и трансдукции нанесено более 2000 генов, что составляет около 60% её генетической ёмкости.

Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что возможно скрещивание между кишечной палочкой и бактериями других видов, а также между бактерями, относящимися к разным видам и даже родам. Процесс конъюгации установлен у практически всех видов кишечных бактерий (сальмонелл, шигелл, эшерихий, холерных вибрионов), а так же псевдомонад, йерсиний и многих других.