Биообъекты, используемые в биотехнологическом производстве и методы их совершенствования.

План лекции

1. Понятие биообъекта.

2. Классификация биообъектов как продуцентов лекарственных и диагностических препаратов и их функции.

3. Макромолекулы природного происхождения – промышленные биокатализаторы.

4. Совершенствование биообъектов методами мутагенеза и селекции.

5. Мутации

а) понятие

б) мутагены

в) классификация

6. Вариационный ряд.

7. Методы отбора.

8. Мутасинтез.

9. Совершенствование биообъектов методами клеточной инженерии.

а) этапы работы

б) перспективы

Самым главным элементом биотехнологического производства, определяющим его специфику, является биообъект.

Биообъектом может быть целостный, сохранивший жизнеспособность, многоклеточный или одноклеточный организм. Им могут являться изолированные клетки многоклеточного организма, а также вирусы и выделенные из клеток мультиферментные комплексы, включенные в определенный метаболический процесс. Наконец, биообъектом может быть индивидуальный изолированный фермент.

Функция биообъекта – полный биосинтез целевого продукта, включающий обычно ряд этапов, то есть последовательных ферментативных реакций или, в крайнем случае, катализ лишь одной ферментативной реакции, которая имеет ключевое значение для получения целевого продукта.

Биообъект, осуществляющий полный биосинтез целевого продукта принято именовать продуцентом. Иммобилизированный биообъект, являющийся индивидуальным ферментом или выполняющий функцию одной ферментативной реакции используемой биотехнологом – именуют промышленным биокатализатором.

Таким образом, к биообъектам могут быть отнесены как макромолекулы, так микро- и макроорганизмы, то есть от вирусов до человека. В качестве макромолекул в промышленном производстве используются все известные классы ферментов, но наиболее часто - гидролазы и трансферазы.

Наиболее широко в качестве биообъектов используются микроорганизмы. Как биообъекты, микробные клетки прокариот и эукариот в современном биотехнологическом производстве являются продуцентами первичных метаболитов, используемых в качестве лекарственных средств: аминокислот, азотистых оснований, липидных структур, коферментов, моно- и дисахаров, ферментов медицинского назначения, применяемых в заместительной терапии и т.д.

Микроорганизмы образуют также огромное количество вторичных метаболитов, многие из которых также нашли применение в клинике. Например, гормоны, антибиотики, витамины и другие перспективные корректоры гомеостаза клеток млекопитающих.

Итак, что же мы подразумеваем под термином "совершенствование биообъекта"? - Прежде всего – это повышение продуктивности биообъекта. Далее, какие же изменения нужны при совершенствовании биообъекта? - только наследственные. Это изменения, локализованные в ДНК, передающиеся при репликации ДНК и, соответственно, при размножении биообъекта (наследственные изменения). Только это, собственно, и интересует биотехнологов. То есть, наследственные изменения фенотипа - это изменения, которые реализуются, при изменении ДНК.

По выраженности почти любого признака в микробной популяции составляют вариационный ряд. Большинство клеток имеют среднюю выраженность признака.

Итак, по каким же специфическим свойствам мы совершенствуем биообъект?

1. Продуктивность

2. Экономичность (микроорганизм использует более дешевую и питательную среду).

3. Дефицитность (микроорганизм использует более доступную питательную среду).

4. Вязкость (в случае жидкой культуральной среды).

Поскольку из цеха ферментации культуральная среда (жидкость) идет в цех выделения и очистки, то там сотрудники часто жалуются на высокую вязкость культуральной жидкости, в результате чего мицелий невозможно ни отцентрифугировать, ни отфильтровать. Значит, задача селекционеров - улучшение свойств культуральной жидкости.

5. Промышленная гигиена.

Например, когда нарабатывается антибиотик цефалоспорин, очень трудно находиться в помещении (запах тухлой капусты). Значит, в идеале штамм должен выделять как можно меньше летучих веществ.

6. Устойчивость к заболеваниям.

Вы знаете, что если у вас биообъект – растение, то он может быть поражен бактериями, грибами и т.д. А если у вас биообъектом является микробный гриб или актиномицет, то он может быть поражен фагами (т.е. микробными вирусами).

Если рассмотреть цели клеточной инженерии, то можно сказать, что в идеале с ее помощью мы можем получать межвидовые и межродовые гибриды микроорганизмов, а также – можем получать гибриды клеток между отдаленными в эволюционном отношении многоклеточными организмами. Новое направление в биотехнологии – сочетание клеточной инженерии с инженерной энзимологией непосредственно в производстве.

 

Лекция №3

Совершенствование продуцентов (биообъектов) методами генетической инженерии.

План лекции

1. Понятие генетической инженерии.

2. Схема этапов работы генного инженера.

3. Факторы, определяющие выбор микроорганизма-продуцента.

4. Понятие и функции плазмидного вектора.

5. Функции рестриктаз и лигаз.

6. Гены-маркеры.

7. Явление сплайсинга

Наибольшие практические успехи генетической инженерии применительно к биотехнологии лекарств достигнуты в настоящее время в области создания штаммов микроорганизмов-продуцентов видоспецифичных для человека белков. Такие белки для микробной клетки являются чуждыми, в организме же человека одни из них играют роль биорегуляторов (белковые гормоны), другие – факторов врожденного иммунитета (интерфероны) и т. д.

Технология рекомбинантных ДНК (её называют также молекулярным клонированием или генной инженерией) – это совокупность экспериментальных процедур, позволяющая осуществить перенос генетического материала из одного организма в другой. Никакого единого универсального набора методик здесь не существует, но чаще всего эксперименты проводятся по строго определенной схеме. Генетическая инженерии – это соединение фрагментов ДНК (природного происхождения, синтетических или тех и других) в пробирке, т. е. in vitro и последующее введение новых (рекомбинантных) структур в живую клетку с тем условием, чтобы введенный, точно охарактеризованный фрагмент ДНК реплицировался после включения в хромосому или автономно экспрессировался.

Схему этапов работы генного инженера.

1. Соединение фрагментов ДНК, т.е. нуклеотидных последовательностей в пробирке (могут быть и синтетические последовательности или смесь природных и синтетических последовательностей).

2. Далее, к гену, кодирующему целевой белок присоединяется нуклеотидная последовательность, кодирующая так называемую лидерную последовательность аминокислот (преимущественно гидрофобных). Синтезированный в клетке целевой продукт с такой лидерной последовательностью аминокислот проходит с их помощью через липидные слои цитоплазматической мембраны из клетки наружу.

3. Затем, производится включение гена в клетку, но «не прямо в клетку, конечно» так как, вы понимаете, что клетка окружена оболочкой и для включения в неё генов приходится использовать так называемые «транспортные устройства» на основе плазмид.

При выборе микроорганизма учитывается ряд обстоятельств.

1. Поскольку микроорганизм будет выращиваться в производственных условиях в большом количестве и с ним будут контактировать многие работники предприятия (биологи, химики и т.д.), поэтому желательно, чтобы он не был патогенным. Также необходимо, чтобы в целевом генно-инженерном продукте не было присутствия даже следов микробных токсинов.

2. Как чужеродная для клетки структура, проникший в клетку вектор не должен расщепляться нуклеазами клетки. Генетический материал должен сохраняться.

3. У будущего продуцента целевого продукта необходимо ослабить те системы репарации на уровне ДНК, которые могут уничтожить вектор. То есть рибосомы потенциального продуцента должны воспринимать информационную РНК, соответствующую чужеродному материалу.

4. Образовавшийся чужеродный для клетки белок (для биотехнолога - целевой продукт) не должен расщепляться ее протеазами, т.е. он не должен подвергаться воздействию систем, гидролизующих чужеродные белки.

5. Наконец, желательно, чтобы у потенциального продуцента чужеродного белка, последний выводился из клетки в среду. Этим облегчается его последующее выделение и очистка.

Таким образом, нужно иметь ген, подходящую клетку и транспортное устройство, которое получило название вектор. Вектор конструируется на основе плазмид. Плазмида состоит из 2-х спиральной ДНК (замкнутая кольцевая молекула), в принципе тоже самое, как и у бактериальной хромосомы. Отличие заключается в том, что плазмида раз в 100 меньше хромосомы. Например, если в бактериальной хромосоме содержится примерно 3000 генов (от 1 тысячи до 6-7 тысяч), то в плазмиде - примерно 30 генов.

Так вот, надо. Что используется для этого? Для того чтобы ввести ген в вектор используются ферменты рестриктазы (от слова restrict - разрезание), которые по биохимической классификации относятся к нуклеазам (к эндонуклеазам). Затем, чтобы ген закрепить прочно в векторе (транспортном устройстве) вступают в действие другие ферменты - это лигазы (от слова "лигатура" - сшивание), которые "сшивают" ген и вектор ковалентной связью.

Сплайсинг (от англ. splice - сращивать или склеивать концы чего-либо) - процесс вырезания определенных нуклеотидных последовательностей из молекул РНК и соединения последовательностей, сохраняющихся в «зрелой» молекуле, в ходе процессинга РНК. Наиболее часто этот процесс встречается при созревании информационной РНК (иРНК) у эукариот.

 

 

Лекция №4

Геномика и протеомика

План лекции

1. Периоды развития генетики.

2. Секвенирование генома.

3. Цель и классификация геномики.

4. Модельные микроорганизмы.

5. Существенность гена.

6. Философские проблемы геномики.

7. «house kеeping genes» и «ivi genes».

8. Система «IVET».

9. Протеомика.

 

Что собственно значит геномика? Чем она отличается от генетики? Геномика во главу угла ставит уже не ген, а полный геном микробной, растительной и животной клеток. Геном - это уже качественный скачок вперед, демонстрирующий преодоление массы трудностей как технических и теоретических. Итак, геном прокариот, как вы знаете, в наследственном, т.е. генетически рассматриваемом отношении - это одна хромосома, т.е. кольцевая, замкнутая ДНК. Что касается генома эукариот (помните, там оформленное ядро, мембрана), то он, как правило, сложнее, так как клетки эукариот имеют несколько хромосом. У прокариот геном - гораздо проще, чем у эукариот, количество генов у них гораздо меньше, чем у эукариот. И мы с вами будем рассматривать некоторые примеры, используя клетки именно прокариот, геном которых является более простым.

Теперь, геномика расматривающая ген целиком, возможна только тогда, когда осуществлено секвенирование этого гена. От (англ.) секвенс- последовательность. В данном случае «секвенс» - последовательность нуклеотидных пар ДНК. Цель геномики - установление полной генетической характеристики всей клетки: установление количества содержащихся в ней генов и их последовательности, установление количества нуклеотидов в каждом гене и их последовательности, установление функций каждого гена применительно к метаболизму организма.

Несмотря на то, что геномика как наука, возникла относительно недавно, условно можно выделить определенные направления. Ну сама по себе геномика - это структурная оценка генома в целом: вы определяете путем секвенирования последовательность пар нуклеотидов, то есть сначала структуру отдельного гена, а затем и структуру всего генома.

Однако по ряду отдельных вопросов вы ведете исследования в направлении, так называемой сравнительной геномики. Значит, секвенируете геномы и гены в разных организмах и сопоставляете их друг с другом и решаете определенные теоретические и практические вопросы.

Еще одно очень важное направление, оказавшееся в дальнейшем ещё и очень трудоемким - это геномика функциональная или метаболическая. Идентификация генов проводится с помощью специальных компьютерных программ, в которых описаны геномы так называемых модельных микроорганизмов.

Теперь следующий очень важный момент - у каждого гена есть стартовая часть, есть детерминирующая часть и есть рамка считывания, т.е. структурный ген, которой индивидуален для каждого гена. А вот стартовая и детерминирующая части, как правило, стандартны (за редким исключением).

Итак, важнейшая проблема заключается в том, - каким образом от шифра перейти к функции.