Аминокислота - целевой продукт

. Синтез треонина. Особенности регуляции биосинтеза треонина в клетках Escherichia coli (кишечной палочки). В этом случае ситуация другая. У кишечной палочки нет механизма согласованного ингибирования ферментативной активности, то есть, если лизин ингибирует активность своих ферментов по принципу обратной связи, то треонин – своих ферментов. Кроме того, имеет место «репрессия» всего комплекса треониновых ферментов при избытке треонина или изолейцина и это похоже на «согласованную репрессию» Самостоятельно (по отдельности) ни треонин, ни изолейцин не репрессируют синтез ферментов.

Для решения задачи получения треонина в необходимых количествах пришлось сделать следующее:

1. изменить, сделать нечувствительным к треонину первый фермент треонина

2. снизить активность фермента, синтезирующего из треонина изолейцин

3. убрать механизм репрессии при недостаточном количестве изолейцина несмотря на избыток треонина

4. применить генную инженерию (выделить треониновые гены и размножить их на плазмидах в клетке микроорганизма, резко повысив синтез треонина клетками продуцента)

В рассматриваемом случае синтез треонина отличается от синтеза лизина тем, что его синтез происходит одновременно с ростом биомассы. Здесь уже нет двух стадий.

Особенности культивирования штаммов-продуцентов аминокислот приводят к следующему результату:

1. достигаются максимально высокие скорости синтеза аминокислот клетками продуцента

2. достигается максимальная длительность работы продуцента

3. минимально образуются побочные продукты биосинтеза аминокислот.

Первая задача решается путем выращивания высокоактивной биомассы и помогают в этом случае наличие в питательной среде: источников углерода,аммонийного азота, минеральных солей, ростовых факторов; оптимизация рН (кислотность среды) температуры; дробная подача субстратов.

Для предотвращения закисления среды проводят автоматическое рН- статирование аммиачной водой и источниками углерода.

В случае биосинтеза лизина добавляют ростовые факторы по мере необходимости, что зависит от самого сырья, от аппаратуры, от температуры.

Процесс биосинтеза энергоемкий и требует интенсивной аэрации и перемешивания.

Для длительной работы ауксотрофных продуцентов лизина в питательную среду вносят комплексный источник аминокислот (белковые гидролизаты).

Тсх( Проводят карандашом линию на расстоянии 2 см от нижнего края хроматографической пластины. На линии на равном расстоянии размечают 4 точки. В пипетку набирают раствор первой аминокислоты. Прикасаясь кончиком пипетки к пластине в точке 1, выпускают раствор. То же проделывают для точек 2, 3, 4 с растворами оставшихся аминокислот и их смесью, каждый раз используя чистую пипетку.

Хроматограмму помещают в хроматографический сосуд, на дно которого налита смесь бутанола, уксусной кислоты и воды (15:3:7) так, чтобы край пластины был погружен в проявитель на 1 см. Сосуд плотно закрывают крышкой и оставляют в нем хроматограмму на время, за которое проявитель пройдет по ней путь снизу вверх, равный примерно 10 см. Хроматограмму вынимают из сосуда, отмечают границу фронта проявителя и высушивают на термостолике. На высушенную хроматограмму наносят в спрей-камере при помощи пульверизатора 0,5%-ный раствор нингидрина в ацетоне до равномерного (без подтеков) смачивания. Затем хроматограмму помещают на термостолик при температуре 70 °С на 15 мин. Позиции аминокислот на хроматограмме выявляются в виде сине-фиолетовых пятен.

 

Идентификацию аминокислот можно осуществить по значению R_f (коэффициент распределения). Для этого измеряют расстояние, пройденное проявителем от линии старта до границы фронта проявителя, а так же расстояние от точки нанесения каждой аминокислоты до центра цветного пятна, образовавшегося в результате нингидриновой реакции. Путем деления величины пути, пройденного аминокислотой на хроматограмме, на величину пути, пройденного проявителем, находят значение коэффициента распределения (R_f) каждой аминокислоты-свидетеля. Такие же расчеты проводят с аминокислотами исследуемой смеси. Сопоставляя величины R_f аминокислот-свидетелей и аминокислот исследуемой смеси, делают заключение о природе аминокислот в составе изучаемой смеси. Аминокислоты, располагающиеся на одном уровне, идентичны.

Билет 16

Виды процессов биосинтеза. Процесс биосинтеза подразделяют на:

• периодический,

• полупериодический,

• непрерывный,

• многоциклический.

 

Любой биотехнологический процесс (лабораторный или промышленный) реализуют условно в три основных этапа. Первый из них – подготовительный (предферментация), когда необходимо выполнить все подготовительные работы (подготовка и стерилизация питательных веществ (субстрата для культивирования микроорганизмов-продуцентов), наработка (накопление) используемого продуцента, стерилизация и подготовка основного оборудования (реактора – ферментера). Второй этап – основной (ферментация) включает в себя стадию культивирования соответствующего микроорганизма-продуцента и накопления (наработки) целевого продукта. На третьем этапе – постферментационном осуществляется выделение и очистка целевого продукта.

Основные технологические стадии биотехнологического процесса включает:

1. приготовление и стерилизацию питательных сред

2. приготовление посевного материала

3. культивирование

4. обработку культуральной жидкости

5. выделение и очистку биопрепарата

6. получение готовой продукции

 

К определяющим факторам биотехнологического процесса относят:

· Вид используемого биотехнологического процесса

· Субстрат с его биохимическими и биофизическими характеристиками

· Аппаратурное оформление, включая систему контроля управления

· Технологический режим

· Соответствие требованиям GMP.

Моноклональные антитела

Способ получения моноклональных антител. Такой способ был предложен в 1975 году учеными Г.Келером и К. Мильштейном. Они вводили антиген в организм мыши и получали активно продуцирующие антитела β- клетки. Эти клетки могут жить только в организме хозяина, но если соединить иммунную клетку с клеткой опухолевой (эти клетки называют миеломные лимфоциты), то образуются гибридные клетки со свойствами своих предшественников, так как они способны долго жить в искусственных условиях и одновременно синтезировать антитела. Такие клетки называются гибридомами. Существуют методы отбора отдельных клеток, синтезирующих только один тип антител. Такие клетки помещают в культуральную жидкость, где они растут, образуя много родственных «клонов», синтезирующих большое количество антител под названием моноклональных. Отсюда возникает название монаклональные антитела.

Биотехнология получения моноклональных антител

1. Иммунизация животных – производят иммунизацию животных (мышей), от которых в дальнейшем получают селезеночные клетки (спленоциты), синтезирующие иммуноглобулины (антитела)

2. Гибридизация – создание гибридных клеток, образующих антитела.

После иммунизации необходимо изолировать антителообразующие клетки и размножить в клеточной культуре. Но плазматические клетки, продуцирующие антитела, не способны к размножению и продолжительной жизни в клеточной культуре. Этот барьер преодолевают созданием гибридных клеток, образующих антитела.

Исходным материалом для получения гибридов являются антителообразующая клетка селезенки и быстро делящаяся раковая клетка.

В результате образуется продукт слияния, который обладает способностью к беспредельному размножению в клеточной культуре и биосинтезу одного вида антител.

3. Селекция – производят выделение гибридов путем высева на селективную среду.

4. Клонирование – происходит идентификация и отбор гибридов, продуцирующих специфические иммуноглобулины.

5. Массовое культивирование отселектированного клона гибридом:

2 метода:

1. В виде перевиваемой культуры клеток

2. В виде развития асцитной опухоли, которая развивается в результате введения гибридомной клеточной взвеси мышам в\брюшинно.

В дальнейшем получают асцитную жидкость, из которой выделяют моноклональные антитела.

Концентрация моноклональных антител в клеточной культуре составляет 10³, при втором пути – 105-106 моноклонального антитела в 1мл жидкости.

Билет 17

1) Антибиотиками называют продукты жизнедеятельности организмов, обладающие антибактериальным действием. Большинство известных в настоящее время антибиотиков являются веществами, выделяемыми различного вида микроорганизмами – бактериями, дрожжами, плесенями, актиномицетами. Антибиотики получены также из животных тканей и высших растений (фитонциды).

1. Периодическое культивирование. При этом способе весь процесс развития микроорганизмов полностью завершается в одном ферментаторе, после чего ферментатор освобождается от культуральной жидкости, тщательно промывается, стерилизуется и вновь заполняется свежей питательной средой. Среда засевается изучаемым микроорганизмом, и процесс возобновляется.

2. Отъемный метод. Культивирование микроорганизмов осуществляется в ферментаторах с периодическим отбором части объема культуральной жидкости в ферментаторе и доводится свежей питательной средой до исходного уровня.

3. Батарейный способ. Микроорганизмы развиваются в ряду последовательно соединенных ферментаторов. Культуральная жидкость на определенной стадии развития микроорганизма перекачивается из первого ферментатора во второй, затем из второго в третий и т. д. Освобожденный ферментатор немедленно заполняется свежей питательной средой, засеянной микроорганизмом. При этом способе выращивания микроорганизмов емкости используются более рационально.

4. Непрерывное культивирование. В основе метода лежит принцип непрерывного протока питательной среды, что позволяет поддерживать развитие микроорганизма на определенной стадии его роста. Стадия развития микроорганизма определяется тем, что в этот период происходит максимальный биосинтез антибиотика или другого биологически

активного соединения. Установлено, что в условиях непрерывного процесса биосинтеза некоторых антибиотиков можно получить хорошие результаты, если процесс вести в две стадии. В первом аппарате батареи поддерживают высокую скорость потока, обеспечивающую большую скорость роста продуцента антибиотика, с тем, чтобы получить высокоактивную биомассу, а во втором аппарате – обеспечивают низкую скорость потока и соответственно небольшую скорость роста. Процесс непрерывного культивирования – перспективное направление современной биотехнологии.