Биохимические свойства бактерий

Состав ферментов синтезируемый любой бактерией определяется ее геномом и является довольно стабильным признаком. Бактерии синтезируют разнообразные ферменты, принадлежащие к 6 основным классам.

Определение сахаролитических, протеолитических и других ферментов, образуемых определенными видами и даже вариантами (биоварами) бактерий имеют важное таксономическое значение, широко применяясь в систематики и идентификации. Целый ряд ферментов (гиалуронидаза, коагулаза, фибринолиз и др.) способствуют проявлению патогенных свойств бактерий, поскольку мишенью их действия являются клетки и ткани организма человека. Эти ферменты называют ферментами патогенности (подробно о ферментах данной группы будет рассмотрено в разделе «Инфекция»).

Ферменты бактерий могут локализоваться в цитоплазме, цитоплазматической мембране или периплазматическом пространстве бактерий, это так называемые эндоферменты, другие – экзоферменты, выделяются в окружающую среду.

Функциональное значение экзоферментов связано с расщеплением макромолекул органических и неорганических веществ в окружающей среде до более простых соединений. Они осуществляют контактное и внеклеточное переваривание веществ, повреждают ткани своих хозяев и др.

У бактерий различают три основные группы ферментов:

Конститутивные – постоянно синтезируемые бактериальной клеткой.

Индуцибельные (адаптивные) – синтез которых индуцируется соответствующим субстратом.

Репрессибельные – синтез которых подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом.

Одной из особенностей синтеза бактериальных ферментов является преобладание индуцибельных ферментов над конститутивными, что связано как с малым объемом протоплазмы, так и с их ролью главного механизма адаптации к меняющимися условиям внешней среды.

Другой особенностью синтеза ферментов у гетеротрофных бактерий является их выделение в огромном количестве в окружающую среду. Ферменты могут функционировать независимо друг от друга или быть тесно связанными между собой, обеспечивая протекание метаболических реакций в строгой последовательности. Последних называют – мультиферментные комплексы, например ферменты дыхательной цепи, локализованные на цитоплазматической мембране.

Определение ферментов используют для идентификации бактерий – возбудителей инфекционных болезней, помимо изучения морфологических и культурных свойств.

К биохимическим свойствам относят: сахаролитические, протеолитические свойства, пигментообразование, токсинообразование.

Сахаролитические свойства. Бактерии характеризует неодинаковая способность использовать различные углеводы. Ферментация углеводов бактериями приводит к образованию органических кислот, либо кислот и газов. Определение сахаролитических ферментов проводят на дифференциально-диагностических средах Гисса. Среды Гисса состоят из 1% пептонной воды, 0,5% определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза и др.), индикатора Андреде (кислый фуксин в 1н. растворе NaOH). В пробирку со средой опускают поплавок (стеклянная трубочка один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов. Свежеприготовленная среда имеет соломенно-желтый цвет. Исследуемую культуру засевают в пробирку. Результаты посевов учитываются через 24-48 часов. О разложении углеводов судят по изменению цвета среды. Среда приобретает красный цвет, в результате сдвига рН в кислую сторону, за счет образования кислоты. О газообразовании свидетельствует накопление газа в поплавке.

Рис. Пробирка со средой Гисса до посева материала

 

Рис. Пробирка со средой Гисса после посева

 

Протеолитические ферменты – протеазы, катализирующие расщепление белка. На практике о протеолитической активности бактерий чаще судят по способности расщеплять белок до продуктов глубокого распада: индола и серововодорода. Для этого исследуемую культуру засевают на МПБ, между пробкой и горлышком пробирки укрепляют индикаторные бумажки. На сероводород – индикаторная бумажка пропитана уксуснокислым свинцом. При выделении Н2S – она чернеет. На индол – индикаторная бумага - пропитана раствором щавелевой кислоты, при выделении индола – она краснеет.

Рис. Проявление протеолитических свойств

 

Сахаролитические и протеолитические ферменты микроорганизмов весьма многообразны и универсальны (часто встречаются у представителей разных видов). Это обусловливает относительно невысокие дифференцирующие свойства традиционных сред. Для более четкой дифференциации культур у них желательно определять родо- и/или видоспецифические ферменты. В конце ХХ века в бактериологическую практику вошли дифференциальные среды нового поколения – хромогенные, принцип действия которых основан на выявлении высокоспецифичных ферментов у искомых микроорганизмов. К таким ферментам относятся, например, бета-D-глюкуронидаза Escherichia coli или бета-D-глюкозидаза энтерококков. Для обнаружения уникального фермента и, соответственно, идентификации микроорганизма, в состав среды вводят хромогенный субстрат – вещество, при расщеплении которого образуются окрашенные и/или флюоресцирующие продукты. В результате микробный рост окрашивается в определенный цвет или приобретает способность к флюоресценции при ультрафиолетовом облучении. Поскольку хромогенный субстрат или их смесь вводятся в состав сред (в том числе селективных) для первичного посева, то результат – выделение чистой культуры и ее идентификация – может быть получен уже в течение первых суток исследования.

Рис. Рост различных видов бактерий на хромогенных средах

 

Пигменты – красящие вещества различных классов химических соединений, выделяемых в среду или входящие в состав клеток. Синтезирующие пигменты бактерии чаще встречаются среди обитателей воздуха, почвы, воды. Они, как правило, защищают микробную клетку от ультрафиолетовых лучей. Среди патогенных для человека бактерий пигментообразование мало характерно. Данный признак относительно постоянен и цвет пигмента используют для идентификации пигментообразующих бактерий. Пигменты каратиноидного класса, имеющие желтые, лимонные, оранжевые тона, синтезируют стафилококки (S.aureus), микобактерии (M.tuberculosis, M.bovis). Растворимый в воде сине-зеленый пигмент пиоцианин синтезирует синегнойная палочка (P. aeruginosa). Пирагалолловый пигмент красного цвета продигиозин продуцируют серрации (S.marcescens).

Рис. Лимонно-желтые колонии S.aureus

Рис. Рост микобактерий на среде Левенштейна-Иенсена

Каталаза – железосодержащий фермент, катализирующий реакцию расщепления Н2О2 на воду и кислород. Присутствует у большинства аэробных и факультативно-анаэробных бактерий и отсутствует у облигатно анаэробных. Для определения в каплю Н2О2 на предметном стекле вносят испытуемую культуру. При наличие каталазы сразу же или через несколько секунд появляются пузырьки.

Рис. Тест на каталазу

Оксидазы – группа ферментов, характерных для аэробов и отсутствующих у анаэробов и большинства факультативно-анаэробных бактерий. Для определения на фильтровальную бумагу смоченную 1% р-ром тетраметилпарафенилдиамин-дегидрохлорида (реактив Кодака) наносят полосу из испытуемой культуры. В положительном случае через несколько секунд появляется фиолетовое окрашивание.

Рис. Тест на оксидазу

 

Коммерческие тест-системы

В настоящее время для биохимической идентификации бактерий используются коммерческие тест-системы отечественного и зарубежного производства: система индикаторная бумажная (СИБ), различные мультимикротесты (ММТ), тест-системы API, автоматизированные бактериологические идентификационные анализаторы. Учет результатов может проводиться визуально или автоматически.

Система индикаторная бумажная (СИБ) – набор бумажных полосок и дисков, пропитанных различными субстратами и индикаторами, которые помещают в пробирки с взвесью изучаемой культуры. Учет результатов производят визуально в соответствии с цветовым указателем, после суточного инкубирования в термостате. Идентификацию культур бактерий проводят с использованием таблиц их биохимических свойств и диагностических «ключей». СИБ дает возможность определить продукцию индола, уреазы, декарбоксилаз аминокислот, сахаролитические свойства бактерий. Производство Нижегородского НИИЭМ «Диагностические системы».

Рис. Система индикаторная бумажная (СИБ)

Мультимикротесты (ММТ) представляют собой пластиковые планшеты, в лунках которых находятся различные субстраты с индикаторами, на которые наносится взвесь изучаемой культуры. После суточного инкубирования в термостате по изменению цвета содержимого лунок судят о биохимических свойствах культуры.

Рис. Изменение цвета содержимого лунок в планшете мультимикротеста

 

Одной из наиболее известных диагностических систем является тест-системы API 20E и API 50CH производства «bioMerieux» (Франция). API системы, стали применяться в бактериологии с 1970г. и благодаря простоте в использовании и прекрасным рабочим характеристикам стали референсным методом идентификации во всем мире. В настоящее время API предлагает самый полный спектр систем для идентификации. Она включает 15 систем, покрывающих практически все группы бактерий и грибов; всего - более 600 видов.

Рис. Результаты идентификации трех культур тест-системой API

Автоматизированные бактериологические идентификационные анализаторы состоят из бактериологического анализатора, идентификационных панелей и программного обеспечения. Cовременные анализаторы, разработанные для автоматизации и стандартизации процесса микробиологического анализа, проводят: идентификацию микробов, определение чувствительности к антибиотикам и статистическую обработку результатов исследования. Идентификация производится на основе системы биотипирования микроорганизмов по более чем 30 биохимическим реакциям одновременно. Полный анализ проходит от 4 до 24 часов, в зависимости от вида микроорганизма. Спектр идентификации включает более 400 видов клинически значимых микроорганизмов.

Рис. Врач бактериолог за работой на автоматизированном бактериологическом анализаторе. Компания Ситилаб, Казань