Фазовые переходы в липидном бислое

Молекулярную основу различий между фазами мембранами составляют конформации жирно-кислотных цепей. Отдельная жирно-кислотная цепь может принимать множество конформаций благодаря вращению вокруг одинарных С-С - связей. В липидном бислое за счет плотной упаковки молекул в норме реализуются преимущественно две плоские конформаций углеводородной цепи - транс- и цис-конформации, но существуют и промежуточные

В твердом состоянии все молекулы фосфолипида обладают транс-конформацией углеводородных цепей жирных кислот, что определяет их ограниченную подвижность в БЛМ. В этом случае осуществляются лишь небольшие согласованные колебания или вращательные движения (прецессия) возле точки крепления жирной кислоты и полярной группы ФЛ. В жидком состоянии БЛМ возможны тепловые движения жирно-кислотных цепей, сопровождающиеся транс-гош-переходами. Важно отметить, что расположенные рядом гош-конформации могут образовывать полости в бислое (так называемые кинки), в которые и попадают молекулы, «захваченные» из раствора. Кинки Возможность изменения конфигурации цепей жирных кислот имеет большое значение для растворения в липидном слое и переноса через него различных молекул и ионов. Ион попадает в полость внутри липидного бислоя, образуемую за счет соответствующих изгибов окружающих цепей жирных кислот.

Такая полость называется кинком (от английского слова kink - петля, изгиб). Кинки образуются в результате теплового движения молекул и ион может перемещаться в липидном слое мембраны, перескакивая из одного кинка в соседний (слайд 18). Формирование кинка сопровождается уменьшениием эффективной длины цепи на 0,13 нм. При этом часть цепи отодвигается на 0,15 нм, образуя свободный объем, в результате общий объем липида увеличивается на 0,025 — 0,050 нм3. Согласно современным представлениям структура кинка способна к диффузии (т.е. к перемещению).

Образование одного кинка облегчает возникновение кинков в соседних цепях, стимулируя их чередование в липидах ПМ. Появление в ходе такого процесса так называемых кинк-блоков (нескольких кинков) приводит, как правило, к разупорядочениости структуры мембраны. Вероятно, трансмембранный перенос малых молекул через мембрану осуществляется внутри свободного объема кинк-блока.

8. Липосомы, или фосфолипидные везикулы (пузырьки), получают обычно при набухании сухих фосфолипидов в воде или при впрыскивании раствора липидов в воду. При этом происходит самосборка бимолекулярной липидной мембраны. чаще получаются несферические многоламеллярные липосомы, состоящие из нескольких бимолекулярных слоев, — многослойные липосомы. Отдельные бимолекулярные слои многослойной липосомы отделены водной средой. Толщина липидных слоев составляет, в зависимости от природы липидов, 6,5 - 7,5 нм, а расстояние между ними - 1,5-2 нм. Диаметр многослойных липосом колеблется в пределах от 60 нм до 400 нм и более. Однослойные липосомы можно получить различными методами, например из суспензии многослойных липосом, если обработать их ультразвуком. Диаметр однослойных липосом, полученных этим методом, составляет 25 - 30 нм. Разработаны и другие методы получения однослойных липосом, в том числе диаметром до 400 нм и более.

Липосомы представляют собой в некотором роде прообраз клетки. Они служат моделью для исследований различных свойств клеточных мембран. Липосомы нашли непосредственное применение в медицине. Например, можно заключить внутрь липосом лекарственный препарат и использовать как фосфолипидную микрокапсулу для доставки лекарства в определенные органы и ткани. Липосомы не токсичны (при правильном подборе липидов), полностью усваиваются организмом, способны преодолевать некоторые биологические барьеры. Так, инсулин, заключенный в липосому, защищен от действия пищеварительных ферментов. Проводятся работы по разработке методов липосомальной терапии опухолей, ферментативной недостаточности, атеросклероза. Изучается возможность прицельной доставки лекарственного препарата, заключенного в липосомах, к больному органу или даже к больному участку (в частности, к пораженному участку сердца). Для этого к липосоме присоединяется белковая молекула -антитело к соответствующему мембранному антигену органа-мишени. Липосомы с током крови разносятся по всему организму и задерживаются, оказавшись около органа-мишени.

9. Плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ) другой тип модельных мембран. Такие мембраны получают на маленьких отверстиях диаметром около 1 мм в пластинке из пластика (например, фторопласта), погруженной в водную среду. На отверстие наносят каплю раствора липида (в спирте, хлороформе, гептане или других растворителях). Растворитель диффундирует из раствора в воду, и на отверстии остается пленка липида. Эта пленка спонтанно утончается до тех пор, пока не образуется бимолекулярный слой толщиной около 6 нм. Лишний липид собирается в виде ободка-торуса у краев отверстия Плоские липидные мембраны, наряду с липосомами, широко используются в качестве моделей для изучения электрических свойств мембраны, их проницаемости и других научных исследований. С помощью модельных мембран изучают ряд функций биологических мембран, а том числе, барьерную (например, селективность проницаемости - хорошую проницаемость для воды и плохую для ионов). Можно моделировать биологический транспорт, вводя в модельную мембрану молекулы-переносчики.

10.Флуоресцентные метки Перемещение молекул по поверхности мембраны клетки за время t определено экспериментально методом флюоресцентных меток - флюоресцирующих молекулярных групп. Флюоресцентные метки делают флюоресцирующими молекулы, движение которых по поверхности клетки можно изучать, например, исследуя под микроскопом скорость расплывания по поверхности клетки флюоресцирующего пятна, созданного такими молекулами. Остроумный прием, используемый с целью определения скорости перемещения флюоресцирующих молекул - фотообесцвечивание. В клетку вводят молекулы, меченые флюоресцентными метками, а затем небольшой участок клеточной поверхности (несколько квадратных микрометров) облучают лазерным лучом. Под действием лазерного излучения молекулы теряют способность флюоресцировать. Измеряя скорость восстановления флюоресценции в обесцвеченной области по скорости уменьшения радиуса обесцвеченного пятна, получают оценку скорости латеральной диффузии

11.Рентгеноструктурный анализ Одним из наиболее точных методов исследования структуры молекул, составляющих мембрану клетки, является метод рентгеноструктурного анализа, основанный на дифракции рентгеновских лучей. Как правило, это явление наблюдается в тех случаях, когда на пути лучей встречаются препятствия, сравнимые по размеру с длиной волны луча (для анализа объектов нанометрового диапазона необходимо рентгеновское излучение диапазон длин его волн от 10-5 до 80 нм). Если на исследуемый объект направляют параллельный пучок рентгеновских лучей, а за объектом помещают фотопленку, то на ней фиксируется дифракционная картина. На рентгенограмме наблюдается множество пятен (дифракционных максимумов), образующихся в результате интерференции лучей. Анализ рентгенограммы дает сведения о структуре объекта на молекулярном (и даже атомном) уровне.

Ценность метода заключается в том, что появляется возможность, во-первых, изучить пространственное расположение молекул, точно измерить расстояние между ними, оценить их внутримолекулярную структуру, во-вторых, определить структуру молекулярных компонентов мембраны в нефиксированных клеточных препаратах. С помощью рентгеноструктурного анализа были подтверждены бислойное расположение фосфолипидов и присутствие в мембранах белков, вычислены важные структурные параметры мембраны.

 

12.Электронная микроскопия Наибольшие успехи в раскрытии особенностей строения биологических мембран были достигнуты в электронно-микроскопических исследованиях. В электронном микроскопе достигается увеличение в сотни тысяч раз, что дало возможность исследовать строение клетки, клеточных органелл и биологических мембран.

Недостатком электронной микроскопии является деформация живого объекта в процессе исследования. Перед началом электронномикроскопических исследований клетка проходит через многие стадии предварительной обработки: обезвоживание, закрепление, ультратонкий срез, обработка препаратов веществами, хорошо рассеивающими электроны (например, золотом, серебром, осмием, марганцем и т.п.). При этом изучаемый объект значительно изменяется. Несмотря на это, успехи в изучении клетки при помощи электронного микроскопа несомненны.

Новая информация о строении мембраны была получена с помощью метода "замораживание-скол-травление" (см рис.7). По этому методу клетку охлаждают до очень низкой температуры в жидком азоте. Охлаждение проводится с очень большой скоростью (около 1000 градусов в секунду). При этом вода, содержащаяся в препарате, переходит в твердое аморфное состояние. Затем клетки раскалываются специальным ножом и помещаются в вакуум. Замерзшая вода быстро возгоняется, освобождая поверхность скола (этот процесс и называют травлением). После травления получают реплику (отпечаток со сколотой поверхности) и фотографируют в электронном микроскопе. Замороженные мембраны могут при раскалывании расщепляться в разных направлениях, в том числе и вдоль границы двух липидных монослоев, и поэтому можно видеть их внутреннее строение (рис.6).

Было обнаружено, что имеются белковые молекулы, погруженные в липидный бислой и даже прошивающие его насквозь. Это привело к существенному изменению представлений о строении мембраны.

13. Спектроскопия Наиболее полные сведения об агрегатном состоянии липидных бислоев дают методы радиоспектроскопии ЭПР и ЯМР.

Электронный парамагнитный резонанс - это явление резкого возрастания поглощения энергии электромагнитной волны системой парамагнитных частиц (электронов с некомпенсированными спинами), помещенных во внешнее магнитное поле, при резонансной частоте волны. Спектром ЭПР называется зависимость мощности поглощения Р электромагнитной волны от величины магнитной индукции В. Чем сильнее взаимодействие между атомами и молекулами образца, тем спектры ЭПР шире. По ширине спектров ЭПР можно судить о подвижности молекул вещества.

Так как молекулы фосфолипидов диамагнитны, для ЭПР-исследований биомембран используются спин-зонды и спин-метки - молекулы или молекулярные группы с неспаренными электронами. Несмотря на ценную информацию, которую удалось получить при исследовании биологических объектов методом ЭПР с использованием спиновых зондов, этот метод обладает существенным недостатком - внесение в биологический объект чужеродных молекул-зондов может изменять структуру объекта. От этого недостатка свободен метод ЯМР.

Ядерный магнитный резонанс - это явление резкого возрастания поглощения энергии электромагнитной волны системой атомных ядер, обладающих магнитным моментом, помещенных во внешнее магнитное поле, при резонансной частоте волны.

Магнитным моментом обладают, например, такие ядра, как . Не обладают магнитным моментом такие ядра, как . В биологическом объекте содержится много ядер - протонов, что дает возможность применять для их исследования ЯМР. В ЯМР используются более сильные магнитные поля, а частоты переменного электромагнитного поля меньше (5*107 Гц), чем в ЭПР.

Как и в случае ЭПР, спектры ЯМР тем шире, чем больше вязкость и меньше молекулярная подвижность исследуемого объекта.

Флюоресцентные, ЭПР- и ЯМР-исследования показали, что подвижность фосфолипидных молекул в мембране сравнительно велика, а вязкость мала. В нормальных физиологических условиях липидная часть мембраны находится в жидком агрегатном состоянии. Вязкость липидной мембраны сравнима с вязкостью подсолнечного масла (30-100 мПа*с, для сравнения: вязкость воды при 20о С составляет 1 мПа*с).

14.Исскуственные мембраны Липосомы, или фосфолипидные везикулы (пузырьки), получают обычно при набухании сухих фосфолипидов в воде или при впрыскивании раствора липидов в воду. При этом происходит самосборка бимолекулярной липидной мембраны. Минимуму энергии Гиббса отвечает замкнутая сферическая одноламеллярная форма мембраны. При этом все неполярные гидрофобные хвосты находятся внутри мембраны и ни один из них не соприкасается с полярными молекулами воды (рис. 19). Однако чаще получаются несферические многоламеллярные липосомы, состоящие из нескольких бимолекулярных слоев, — многослойные липосомы. Липосомы представляют собой в некотором роде прообраз клетки. Они служат моделью для исследований различных свойств клеточных мембран.

Липосомы нашли непосредственное применение в медицине Плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ) другой тип модельных мембран. Такие мембраны получают на маленьких отверстиях диаметром около 1 мм в пластинке из пластика (например, фторопласта), погруженной в водную среду. На отверстие наносят каплю раствора липида (в спирте, хлороформе, гептане или других растворителях). Растворитель диффундирует из раствора в воду, и на отверстии остается пленка липида. Эта пленка спонтанно утончается до тех пор, пока не образуется бимолекулярный слой толщиной около 6 нм. Лишний липид собирается в виде ободка-торуса у краев отверстия (рис. 20). Плоские липидные мембраны, наряду с липосомами, широко используются в качестве моделей для изучения электрических свойств мембраны, их проницаемости и других научных исследований. С помощью модельных мембран изучают ряд функций биологических мембран, а том числе, барьерную (например, селективность проницаемости - хорошую проницаемость для воды и плохую для ионов). Можно моделировать биологический транспорт, вводя в модельную мембрану молекулы-переносчики.

В мембрану липосомы научились встраивать белки. Инкрустированные протеиновыми молекулами пузырьки называются протеолипосомами. Они внедряются в медицину. При введении в организм человека протеолипосомы поглощаются клеточными мембранами. Так в составе протеолипосом клеточные мембраны получают вещества, не способные проникнуть в них сами по себе. Сливаясь с БМ, липосомы изменяют их состав. В плазмолемму одной клетки можно включить 300 млн липидных молекул и изменить таким образом основные свойства клеточных мембран (вязкость, проницаемость, ферментную и иммунную способности и т. д.). Важным достоинством подобного вмешательства является то, что протеолипосомы встраиваются не во все клетки организма, а именно в те, которые нуждаются в лечебном воздействии

15.Трансмембранный транспорт Живые системы на всех уровнях организации - открытые системы. Поэтому транспорт веществ через биологические мембраны - необходимое условие жизни. С переносом веществ через мембраны связаны процессы метаболизма клетки, биоэнергетические процессы, образование биопотенциалов, генерация нервного импульса и др. Нарушение транспорта веществ через биомембраны приводит к различным патологиям. Лечение часто связано с проникновением лекарств через клеточные мембраны. Эффективность лекарственного препарата в значительной степени зависит от проницаемости для него мембраны.

Виды транспорта

Пассивный Простая Облегченная диффузия осмос активный ионный насос вторичный акт

16. Пассивный транспорт Под пассивным переносом вещества понимают трансмембранный перенос в направлении действия концентрационного, электрического осмотического и фильтрационного градиента. Различают несколько видов пассивного переноса вещества через клеточные мембраны.все эти виды транспорта можно объединить в три группы.

ПРОСТАЯ ДИФФУЗИЯ.

ПЕРЕНОС ЧЕРЕЗ ПОРЫ

ТРАНСПОРТ С ПОМОЩЬЮ ПРЕНОСЧИКОВ за счет диффузии переносчика вместе с веществом (подвижный переносчик) или эстафетной передачи вещества от одной молекулы к другой (молекулы переносчика образуют временную цепочку поперек мембраны).

Выбор движущих сил, обеспечивающих градиентный (пассивный) перенос зависит от типа переносимой частицы и прежде всего от наличия на ней заряда. Исходя из этого различают пассивный транспорт незаряженных молекул (неэлектролитов) и пассивный перенос ионов (электролитов)

Первый закон Фика отражает тот простой факт, что поток вещества (J) в направлении оси x пропорционален движущей силе, то есть градиенту концентрации dc/dx (слайд 3)

где D – коэффициент диффузии см2×с-1 зависящий от температуры и подвижности и вещества в среде:D = RTu.

где R – газовая постоянная,T – абсолютная температура.u – подвижность вещества в рассматриваемой среде.J – поток вещества клеточную мембрану, размерность моль × см2× с-1.

17. Пассивный транспорт Диффузия – самопроизвольное перемещение вещества из места с большей концентрацией в места с меньшей концентрацией вследствие хаотического теплового движения Прохождение многих незаряженных частиц вещества через мембрану подчиняется законам диффузии.простая диффузия о смос ч ерез липидный слой через поры в липидном слое через белковую пору

18. Облегченная диффузия, происходит от мест с большей концентрацией переносимого вещества к местам с меньшей концентрацией. облегченной диффузией объясняется также перенос через биологические мембраны аминокислот, сахаров и других биологически важных веществ.Отличия облегченной диффузии от простой:

1) перенос вещества с участием переносчика происходит значительно быстрее;

2) облегченная диффузия обладает свойством насыщения: при увеличении концентрации с одной стороны мембраны плотность потока вещества возрастает лишь до некоторого предела, когда все молекулы переносчика уже заняты;

3) при облегченной диффузии наблюдается конкуренция переносимых веществ в тех случаях, когда переносчиком переносятся разные вещества; при этом одни вещества переносятся лучше, чем другие, и добавление одних веществ затрудняет транспорт других; так, из сахаров глюкоза переносится лучше, чем фруктоза, фруктоза лучше, чем ксилоза, а ксилоза лучше, чем арабиноза, и т.д.;

4) есть вещества, блокирующие облегченную диффузию - они образуют прочный комплекс с молекулами переносчика, например, флоридзин подавляет транспорт сахаров через биологическую мембрану.

Облегченная диффузия с подвижным переносчиком с фиксированным переносчиком

19. Облегченная диффузия Молекулы переносчики происходит от мест с большей концентрацией переносимого вещества к местам с меньшей концентрацией. По-видимому, облегченной диффузией объясняется также перенос через биологические мембраны аминокислот, сахаров и других биологически важных веществ. Облегченная диффузия происходит при участии молекул переносчиков. Например, валиномицин - переносчик ионов калия. Молекула валиномицина имеет форму манжетки, устланной внутри полярными группами, а снаружи - неполярными В силу особенности своего химического строения валиномицин, во-первых способен образовывать комплекс с ионами калия, попадающими внутрь молекулы-манжетки, и, во-вторых, валиномицин растворим в липидной фазе мембраны, так как снаружи его молекула неполярна. Молекулы валиномицина, оказавшиеся у поверхности мембраны, могут захватывать из окружающего раствора ионы калия (рис. 25). Диффундируя в мембране, молекулы переносят калий через мембрану, и некоторые из них отдают ионы в раствор по другую сторону мембраны. Таким образом и происходит перенос иона калия через мембрану валиномицином.

20. Активный транспорт - это перенос вещества из мест с меньшим значением электрохимического потенциала в места с его большим значением.

Активный транспорт в мембране сопровождается ростом энергии Гиббса, он не может идти самопроизвольно, а только в сопряжении с процессом гидролиза аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), то есть за счет затраты энергии, запасенной в макроэргических связях АТФ.

Активный транспорт веществ через биологические мембраны имеет огромное значение. За счет активного транспорта в организме создаются градиенты концентраций, градиенты электрических потенциалов, градиенты давления и т.д., поддерживающие жизненные процессы, то есть с точки зрения термодинамики активный перенос удерживает организм в неравновесном состоянии, поддерживает жизнь. Согласно современным представлениям, в биологических мембранах имеются ионные насосы, работающие за счет свободной энергии гидролиза АТФ, - специальные системы интегральных белков (транспортные АТФазы).

В настоящее время известны три типа электрогенных ионных насосов, осуществляющих активный перенос ионов через мембрану (рис. 26). Виды ионных насосов: K+-Na+-ATФаза в цитоплазматических мембранах (K+-Na+-нacoc); Са2+-АТФаза (Са2+-насос); Н+-АТФаза в энергосопрягающих мембранах митохондрий, хлоропластов (Н+-насос, или протонная помпа)

Перенос ионов транспортными АТФазами происходит вследствие сопряжения процессов переноса с химическими реакциями, за счет энергии метаболизма клеток.