Разновидности биосенсоров и их применение.

Разработка биосенсоров относится к наукоемким технологиям и представляет собой одну из ветвей современной биотехнологии. Существует несколько типов биосенсоров.

Ферментные биосенсоры могут быть представлены ферментными электродами, ферментными микрокалориметрическими датчиками, биодатчиками на основе хеми- и биолюминесценции. Принцип рабoты биосенсора достаточно прост. Определяемое вещество диффундирует через полупроницаемую мембрану в тонкий слой биокатализатора, где и протекает ферментативная реакция.

Если при гидролизе какого-либо субстрата ферментом класса гидролаз образуется электрохимически активное соединение, то, контролируя содержание последнего, можно контролировать ферментативную реакцию. Однако в присутствии веществ, являющихся ингибиторами, активность фермента уменьшается, что и обнаруживается по сигналу, регистрируемому электродом. [11]

Ферментные (безреагентные) электроды — устройства, основанные на применении электрохимического способа определения веществ, образующихся в ходе ферментативного превращения. Представляют собой электрод с нанесенным поверхностным слоем (чаще всего природный полимер), содержащим один или несколько иммобилизованных ферментов (иногда фермент может находиться в растворенном состоянии в приэлектродном слое, окруженном мембраной). В зависимости от типа взятого за основу электрода, устройства подразделяют на потенциометрические и амперометрические.

Электроды с иммобилизованными ферментами во много раз долговечнее и позволяют провести несколько сот измерений по сравнению с электродами, в которых используются естественные ферментные препараты (около 50 испытаний). В ходе иммобилизации с помощью специальных реагентов фермент "закрепляют" либо на поверхности адсорбентов, например силикагеля, угля или целлюлозы, либо вводят в пленку пористого полимера, либо ковалентно, то есть с помощью химических связей, "пришивают" к какой-либо подложке. При этом фермент закрепляется, перестает быть пoдвижным, не вымывается из биoслoя, а его каталитическое действие сохраняется. Биoсенсoры могут быть сконструированы по объемной технологии.

Ферментные микрокалориметрические датчики — устройства на основе использования теплового эффекта ферментативной реакции. Состоят из двух колонок (измерительной и контрольной), заполненных носителем с иммобилизованным ферментом и снаряженных термисторами. При пропускании через измерительную колонку анализируемого образца происходит химическая реакция, которая сопровождается регистрируемым тепловым эффектом. Данный тип датчиков интересен своей универсальностью.

Хеми- и биолюминесцентные датчики — регистрируют световое излучение с различной длиной волны, испускаемое продуктами ферментативной реакции в возбужденном состоянии. Конструкция включает колонку с иммобилизованными на носителе ферментами (люциферазой, пероксидазой) и светоприемное устройство. Метод характеризуется крайне высокой чувствительностью, позволяя определять фемтомольные (10^-12 М) количества вещества.

В настоящее время наиболее широко распространен амперометрический биосенсор для определения сахара в крови (на основе иммобилизованной глюкозоксидазы). В качестве физического трансдьюсера в нем использован электрод Кларка. [11]

Для контроля содержания пенициллина в питательной среде для выращивания бактерий используют пенициллиновый электрод — рН-датчик, покрытый иммобилизованным ферментом пенициллазой.

Биосенсоры, основанные на кислородном электроде, позволяют определять разнообразные субстраты ферментов: лактаты, L-аминокислоты, салицилаты, оксалаты, пируваты.

С помощью биосенсоров можно решать и обратную задачу: при некоторой определенной концентрации субстрата по величине измеряемого сигнала оценивать активность самого фермента. Такое применение биосенсоров позволяет измерить активность большого числа ферментов. Оценка активности ферментов, связанных с сердечной деятельностью (аспартамаминотрансфераза, креатинкиназа), дает возможность в клинических условиях оценивать глубину инфаркта миокарда. Измерения активности фермента амилазы используют в педиатрии.

Многие ферменты дoрoги и быстрo теряют свoю активность. Применение бактерий, микроорганизмов и биологических тканей различного происхождения более предпочтительно, поскольку в данном случае oтпадает необходимость в предварительном получении и очистке ферментов. К существенным недостаткам таких биосенсоров можно отнести низкую селективность вследствие того, что клетки живых организмов фактически являются источником самых разнообразных ферментов. Помимо этого время отклика биосенсоров на oснове тканей и микроорганизмов может быть достаточно большим. [12]

Антитела вырабатываются В-лимфоцитами в ответ на антигенные стимулы. При их использовании в качестве биосенсоров, антитела иммобилизуют на поверхности датчика через ковалентное сопряжение аминных, карбоксильных, альдегидных или сульфгидрильных группы. Антитела чувствительны к изменениям рН, ионной силы, химических ингибиторов и температуры. Иммунные датчики обычно используют оптические, флуоресцентные или акустические преобразователи.

Клеточные биосенсоры. Одно из достижений биотехнологии связано с развитием методов включения живых клеток в полимеры и твердые носители различной природы.

Методы иммобилизации клеток сходны с методами иммобилизации отдельных ферментов. Стабильность иммобилизованных клеток определяется их метаболизмом, свойствами носителя и среды. Первоначально для иммобилизации клеток с сохранением их активности применяли материалы природного происхождения: желатин, агар, альгинат кальция, каррагинан. В последние годы разработаны и развиты методы включения живых клеток в синтетические полимерные гели.

Наибольшее применение для иммобилизации нашли клетки микроорганизмов, которые легко культивируются, воспроизводятся и поддерживаются в чистой культуре, а также клетки растений, животных, человека. В отличие от ферментов, при их использовании не требуется дорогостоящих стадий очистки. [11]

Имеющиеся методы позволяют получить клетки, сохраняющие около 100 % активности ферментов и способные функционировать длительные промежутки времени (до нескольких лет). Клетки, как правило, сохраняют все системы жизнеобеспечения, что позволяет проводить сложные последовательные реакции, осуществляя многостадийные процессы.

Для многих типов клеток, особенно микробных, разработаны эффективные методы генетических трансформаций, позволяющие получать мутанты с высоким содержанием того или иного белка или фермента, что дает возможность оперировать высокоэффективными каталитическими системами. Клетки сохраняют аппарат биосинтеза белка. На основе этого могут быть разработаны высокоэффективные методы генодиагностики.

Основные недостатки клеточных биосенсоров заключаются в медленном отклике электрода (что связано с необходимостью использовать толстые мембраны), а также в сравнительно низкой селективности, обусловленной присутствием в клетке или тканях нескольких ферментных систем. В процессе роста и размножения интактные клетки разрушают носитель, а дочерние клетки загрязняют получаемый продукт. Эта проблема решается торможением роста, что достигается созданием дефицита фитогормонов для иммобилизованных клеток растений либо добавлением антибиотиков при применении клеток бактерий.

Биоселективные датчики создают путем нанесения на поверхность ионоселективных электродов целых клеток микроорганизмов или тканей. Для биосенсоров используют различные микроорганизмы: Neigrospora europea — для определения аммиака, Trichosporon brassicae — для определения уксусной кислоты, Sarcina flava — для определения глутамина, Azotobacter vinelaudit — для определения нитратов. На основе гриба Aspergillus niger группой японских ученых созданы биосенсоры для определения биогенных аминов.

Биосенсор на основе иммобилизованных дрожжей между двумя пористыми мембранами и кислородного электрода позволяет определять этанол и метанол, например в промышленных стоках.

Иммобилизованные клетки нашли применение и для синтеза разнообразных химических соединений биотехнологическим способом. Причем биотехнологический синтез предпочтительнее для пищевой и фармакологической промышленности, так как в этом случае продукты получаются более чистыми и дешевыми.

 

В тканевых электродах нашли применение срезы почек и печени свиньи, желтой тыквы, банана. [11]

Тканевые срезы в биосенсорах могут выполнять функцию источников каталитической активности. Тканевые материалы достаточно долго сохраняют высокую специфичность, что очень важно для биосенсора, тогда как выделенные ферменты в тех же условиях быстро разрушаются. [12]

Так, создан биосенсор на аскорбиновую кислоту, состоящий из электрода Кларка и пластины кожуры огурца или тыквы, служащей источником аскорбиноксидазы. Активность фермента в такой природной матрице достаточна для проведения 50-80 определений аскорбиновой кислоты в различных объектах. Установлено, что пластины биоматериала могут храниться без потери активности в течение года в 50%-ном глицерине.

 Аналогичный подход использовали при создании конструкции биосенсора на допамин. В данном биoсенсoре ткань плода банана была иммoбилизoвана на пoверхности кислородного электрода. Известны биосенсоры, в которых испoльзoван цельный фрагмент ткани печени быка, являющийся носителем фермента каталазы и иммобилизованный на кислородном электроде.

 

Прогресс не стоит на месте. В последнее время биоинженеры разработывают ультрачувствительные биосенсоры. В качестве одного из примеров можно привести биосенсор, основу которого составляет графен на основе карбида кремния, который устойчив к чрезвычайно высоким температурам и давлению. Графен имеет превосходные электронные транспортные свойства и высокое соотношение внутренней поверхности к объему, что делает её идеальным материалом для изготовления биосенсоров.

Данный биосенсор обнаруживает биомаркеры рака в крови, слюне и моче. Молекула 8-дегидродеоксигуанозина (8-hydroxydeoxyguanosine, 8-OHdG) появляется в повышенном количестве при повреждении ДНК и связана с повышенным риском развития некоторых форм рака.

Команда исследователей использовала рентгено-фотоэлектронную спектроскопию и спектроскопию комбинационного рассеяния, для подтверждения, что молекулы биорецептора прикрепились к графеновому биосенсору. Когда 8-OHdG связывается с молекулами биорецептора, датчик регистрирует заметное различие в сопротивлении графен-канала. Графеновый биодатчик способен обнаруживать 8-OHdG в низкой концентрации – менее 0,1 нг/мл, что почти в пять раз чувствительнее, чем с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Графеновый биосенсор может также значительно быстрее обнаруживать молекулы-мишени. Ответ готов в течение считанных минут.

Универсальные эпитаксиальные графеновые биодатчики могут быть пригодны для диагностики и мониторинга целого ряда заболеваний, поскольку довольно просто установить конкретные рецепторные молекулы на поверхности графена. [7]

Исследователи из лаборатории нанооптики и плазмоники смогли повысить чувствительность биосенсоров на основе поверхностного плазмонного резонанса с помощью оксида графена.
Как и у любого колебания, у плазменных есть своя частота, а значит, возможно явление резонанса. Плазмонный резонанс возникает, когда луч падающего света фиксированной частоты находится под определённым углом к поверхности, в результате нарушаются условия полного внутреннего отражения и интенсивность отражённого луча падает. Плазмонный резонанс весьма чувствителен к условиям, и если мы возьмём очень тонкий слой металла — толщиной меньше длины волны, — то резонанс будет сильно зависеть от свойств этой самой поверхности. Даже небольшие изменения в структуре поверхности заметно сдвигают условия возникновения резонанса, что позволяет использовать этот эффект для обнаружения сверхмалых количеств веществ.
Как оказалось, сенсоры, в которых использовался оксид графена, в 3—4 раза чувствительнее сенсоров на чистом графене. Кроме того, «оксидный» сенсор после несложной процедуры очистки можно использовать ещё несколько раз. [5]

Появляется новый тип полупроводников, проводящую функцию в которых осуществляют молекулы белков. Такие ферментные системы работают с большей скоростью, чем кремниевые полупроводники. Биочипы имеют небольшие размеры, надежны и способны к самосборке. Японская компания Sony, запатентовала способ производства высококачественных акустических систем из целлюлозы, образуемой бактериями. Гелеобразная целлюлоза высушивается. Полученный материал имеет структуру сот и используется в качестве плоской диафрагмы акустических систем.

 

Биочипы

Биочип – это матрица микроячеек, на которую наносятся биологические макромолекулы-зонды (олигонуклеотиды, фрагменты геномной ДНК, РНК, белки, полипептиды, рецепторы антител, лиганды, олигосахариды, клетки), способные избирательно связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе. Таким образом, это многопараметровый анализ одного биообъекта. Вкупе с прибором - анализатором это мини-лаборатория, помогающая быстро получать самые точные результаты. [13]

У современных микрочипов размеры ячеек лежат в пределах 50-200 микрон; характерные объемы, относящиеся к отдельной ячейке, составляют примерно от 1 нл до 1 мкл; значения концентраций анализируемых макромолекул находятся обычно в пределах до 10 мкМ. Общее число ячеек на чипе составляет 10³-10⁵, а линейные размеры составляют около 1 см.

Каждый микрозонд имеет форму капельки, составляющей около 100 микрон в поперечнике. Все ячейки одного микрозонда одинаковы по размеру и располагаются с плотностью 10-30 «капелек» на 1 мм². Такая технология позволяет на одном биочипе разместить анализатор фактически всего генома человека — от 30 до 100 тыс. генов.

Чаще всего для изготовления чипов служат пластинки из стекла, пластика, полупроводника или металла, на которые наносят биологические макромолекулы (ДНК, белки, ферменты), способные избирательно связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе.

Молекулы исследуемого образца соединяются со своей «парой» (микрозондом), помещенной в одну из нескольких тысяч ячеек на чипе. Например, нити ДНК соединяются со своей комплементарной парой, антиген — со своим антителом, субстрат — со своим ферментом. Наличие того или иного вещества или гена в образце определяют по люминесцентному свечению на прореагировавшем чипе. Флуоресценция является основным методом изучения гибридизации. Также можно использовать методы масс-спектрометрии, атомной силовой микроскопии. [11]

Технология может быть использована в клинической диагностике для определения вирусов и микроорганизмов, гормонов, аллергенов, наркотиков, любых биоактивных веществ в малых концентрациях; в биологических и медико-биологических исследованиях; в криминалистике; для исследования в области экологии и биобезопасности. [13]

Биочипы могут помочь фармакологическим компаниям в создании новых лекарств, в их тестировании. Уже имеются биочипы и для распознавания взрывчатых веществ, химического и биологического оружия, а также их используют как средства идентификации для криминалистики и судебной медицины.

На сегодняшний день существуют три основных типа биочипов: ДНК-чипы, белковые и клеточные чипы.

Основная доля производимых биочипов – ДНК-чипы.

ДНК-чипы представляют собой твердую платформу, на которой сгруппировано в виде точек большое число дезоксиолигонуклеотидов. [8] Материал подложки может состоять из стекла, кремния, гидрогеля, мембранных фильтров и различных полимеров. 

ДНК-чипы способны распознавать последовательности ДНК с заданными свойствами. Принцип действия ячейки ДНК или олигонуклеотидного биочипа основан на комплементарных взаимодействиях осно­ваний в нитях ДНК. Если последова­тельность оснований в одной нити ДНК (или олигонуклеотида) полностью комплементарна по­следовательности другой нити, то образуется ста­бильная двухнитчатая спираль. Однако присутствие в дуплексе даже од­ной неправильной пары предот­вращает образование дуплекса. Если иммобили­зовать в одном из элементов микрочипа специфи­ческую одноцепочечную ДНК или олигонуклеотид, то при добав­лении к микрочипу меченных флюоресцентными красителями фрагментов ДНК будет происходить их высокоспеци­фичное взаимодействие. Биочип, с которым проведена гибридизация, представляет собой скопление светящихся точек. Рассмотреть их можно только при помощи специальных сканеров, отличающихся спектральной чувствительностью и диапазоном.

Гибридизуемая ДНК обычно заранее нарабатывается в достаточных количествах с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Иммобилизуемая ДНК наносится на поверхность через игольчатые растры (пины) механического робота или с помощью технологии типа струйного принтера. Гибридизуемая ДНК в растворе метится с помощью флуоресцентной или радиактивной метки. Свечение ячеек тем сильнее, чем интенсивнее процесс. Анализ прореагировавших чипов производится автоматически с помощью анализатора (чип-детектора), который представляет собой широкопольный микроскоп, соединенный с видеокамерой и компьютером.

В гелевых биочипах ДНК иммобилизуется в слое полиакриламидного геля толщиной 10-20 микрон, нанесенного на специально обработанную поверхность стекла. Иммобилизация осуществляется за счет образования ковалентных связей с помощью фотореакции при облучении ультрафиолетовым излучением. Благодаря трехмерной конфигурации ячейки, в таких биочипах общее число иммобилизуемых молекул ДНК существенно выше, чем в поверхностных микрочипах, что приводит, соответственно, к более сильному сигналу флуоресценции из ячейки. Немаловажно и то, что реакции в объемном геле протекают так же, как и в жидкостях, т. е. как в живом организме. Это позволяет получить результат, максимально приближенный к реальности.

ДНК-микрочипы применяют для:

— идентификации мутаций в генах, связанных с различными заболеваниями;

— наблюдений за активностью генов;

— диагностики инфекционных заболеваний и определения наиболее эффективного метода терапии;

— идентификации генов, важных для продуктивности сельскохозяйственных культур;

— скрининга микроорганизмов, как патогенных, так и полезных. [11]

Они способны находить мутации в генах, сравнивая «больные» и «здоровые» ДНК, отлавливать вирусные и бактериальные ДНК.

Переход от ДНК-микрочипов к белковым микрочипам выглядит вполне логичным шагом, однако его осуществление достаточно проблематично. Структура и функции белковых молекул намного сложнее, чем у молекул ДНК. К тому же белки намного менее стабильны. Каждый тип клеток содержит тысячи различных белков, некоторые из которых обладают уникальными, характерными только для определенного типа клеток, функциями. Кроме того, белковый состав клетки меняется в зависимости от состояния здоровья, возраста и влияния окружающей среды.

Белковые чипы появились сравнительно недавно, с их помощью анализируют антитела, антигены, гормоны, аллергены.

Технология белковых чипов основа на специфическом узнавании антигена и антитела. 

Белковые биочипы могут определять наличие широкого спектра лекарственных веществ, гормонов, наркотиков, ядов, пестицидов практически в любом анализируемом материале, а также множество различных аллергенов, онкогенов, биологически активных веществ и даже генетических дефектов. Биочипы также используют при диагностике физиологических либо патологических изменений, основываясь  на модификации белков. 

Технология белковых биочипов может заменить целые иммунологические лаборатории и увеличить производительность большинства диагностических методов в тысячи раз, резко снизив себестоимость анализов.

Белковые микрочипы предполагается использовать для:

— обнаружения белковых биомаркеров, характерных для различных заболеваний и их стадий;

— оценки потенциальной эффективности и токсичности препаратов в доклинических испытаниях; оценки экспрессии белков с целью выявления мишеней для новых лекарственных препаратов;

— измерения различий в синтезе белков отдельными типами клеток, клетками на разных стадиях развития или здоровыми и патологически измененными клетками;

— изучения взаимосвязи между структурой и функциями белков; взаимодействий между белками и другими молекулами. [11]

Существуют биозонды, определяющие совместимость при переливании крови, анализирующие организм пациентов на гепатит и СПИД.

Используя биочипы, можно диагностировать не только наследственные заболевания, но и болезни, являющиеся результатом прижизненных мутаций в генетическом коде.

Микрочипы помогают изучать молекулярные механизмы и осуществлять проверку действия различных лекарств, причем показания и противопоказания по применению препаратов можно выявлять на индивидуальном уровне.

Фундаментальный принцип, положенный в основу технологии микрочипов, вдохновил исследователей на создание большого числа устройств для решения широкого спектра научных задач и создания новых продуктов. Это тканевые и клеточные микрочипы, микрочипы на основе малых молекул.

Углеводные микрочипы

Примером может служить комплекс гликолипидов с нитроцеллюлозой или поливинилиденфторидом. Благодаря данным чипам можно определить последовательность неизвестных олигосахаридов, опираясь  на структуру вступивших с ними в связь белков, или по взаимодействию сахаров с мембраной можно идентифицировать неизвестные белки.

Тканевые микрочипы позволяют проводить анализ тысяч образцов тканей на одном предметном стекле. Используются для определения содержания белков в здоровых и патологически измененных тканях и для оценки потенциальных мишеней для лекарственных препаратов. Так, например, образцы ткани мозга на предметных стеклах позволяют исследователям измерять изменение электрической активности нервных клеток при различных воздействиях.

Клеточные микрочипы позволяют избежать проблемы нестабильности белков в белковых микрочипах и производить более точный анализ взаимодействий белков внутри клетки.

Микрочипы на основе малых молекул позволяют фармакологическим компаниям производить одновременный скрининг тысяч потенциальных лекарственных средств.

Существенную помощь призваны оказать биочипы и при пересадке органов. Основная проблема при подобного рода операциях заключается в отторжении имплантированных тканей иммунной системой человека. Маркерами, которые находятся в каждой человеческой клетке и служат для идентификации своих клеток, являются белки главного комплекса гистосовместимости. Для того чтобы избежать отторжения, необходимо, чтобы белки-маркеры на имплантированной ткани как можно меньше отличались от белков-маркеров пациента. Биочипы облегчат подбор наиболее подходящих доноров, пересадка органов от которых вызовет минимальный иммунный ответ.

Разрабатываются также биочипы для диагностирования различных форм туберкулеза. В настоящее время появилось множество разновидностей туберкулезной палочки, устойчивых к воздействию антибиотиков. Биочип позволит выявить все известные на сегодняшний день формы возбудителя туберкулеза, а также определить, каким именно антибиотиком нужно лечить конкретную форму заболевания. Причем вероятность выявления биочипом формы заболевания туберкулезом с устойчивыми к лекарствам возбудителями близка к 100%. С помощью этих биочипов можно выявить 29 типов мутаций в гене, ответственном за устойчивость к рифампицину и 19 мутаций в генах, ответственных за устойчивость к изониазиду. Молекулярно-биологический метод гибридизации на микрочипах является высокоэффективным и быстрым (всего 48 часов по сравнению с 2-4 неделями для культурального и биологического методов диагностики туберкулеза) и с одновременным определением резистентности бактерий к противотуберкулезным препаратам. [10]

Биочипы можно применять для контроля за некоторыми смертельно опасными бактериями (возбудителями сибирской язвы, оспы, чумы и бруцеллеза), а также для диагностики гриппа и определения его штаммов. Российские ученые получили грант Американского центра по контролю заболеваний (CDC) для совместной работы по выявлению штаммов вирусов гриппа. Еще один проект касается возможности обнаружения жизни вне Земли, что связано с необходимостью многопараметрического анализа с помощью автономной системы с использованием биочипов.

В настоящий момент широко известны и внедрены биочипы для анализа генетических и клеточных исследований. Недавно создан еще один вид чипа – комплексно-штриховой код крови (Integrated Blood – Barcode Chip – IBBC). [13] По общему принципу действия IBBC во многом напоминает генетический и клеточный биочипы. Для анализа наличия определенных молекул необходимо, чтобы весь поток прошел через разветвленную сеть специфических ловушек, в которых остались бы только те молекулы, на которые эти ловушки настроены. Затем, нужно сделать так, чтобы прореагировавшие ловушки засветились. Тогда, просмотрев чип под микроскопом, можно свериться с картой и узнать – какие белки присутствуют в образце. Каплю крови подают в очень узкий канал на поверхности чипа и под небольшим давлением заставляют кровь пройти вглубь. От главного канала отходит множество боковых, еще более тонких каналов. Каждая полоска покрыта специфическими антителами, притягивающими только один определенный белок. Те полоски, что поймали белки, начинают флуоресцировать красным, причем тем интенсивнее, чем больше молекул-биомаркеров они собрали.

Каждый чип способен одновременно выполнять отдельный химический анализ крови для нескольких пациентов, да еще и по нескольким десяткам белков. Цена одного такого мультитеста оказывается идентичной цене нынешнего анализа плазмы на один единственный белок.

В США испытывали штрих-кодовый тестер в некоторых клиниках для меняющейся концентрации в крови гормона ХГЧ (хорионический гонадотропин человека) у беременной женщины, и что важно, в течение всей ее беременности. При развитии беременности содержание ХГЧ увеличивается в сто тысяч раз. Важно то, что с помощью этого биочипа легко уловить ХГЧ как в очень малых, так и в очень больших концентрациях. Такой широкий диапазон работы – плюс для метода в отличие от химических тестов, которые либо не улавливают низкие концентрации анализируемого вещества, либо улавливают только очень высокую его концентрацию. [13]

Технологию чипов применяли для диагностики с целью прогноза раков молочной железы и предстательной железы у ряда пациентов. Типы и концентрации белков варьируются от болезни к болезни, а также между разными лицами. Женщины с раком молочной железы будут генерировать иной набор биомаркеров по сравнению с мужчинами, страдающими раком простаты, а в то время как у женщин с агрессивной формой рака обнаружены белки, которые отличаются от белков для женщин с менее «смертоносной формой». Концентрации специфических белков могут меняться в ходе лечения, так что биочипы являются удобным монитором сдвигов в состоянии больного.

В практическом отношении применение микрочипов уже сегодня позволяет решать следующие задачи:

· точная постановка диагноза, выявление новых подтипов заболевания, уточнение классификации;

· прогнозирование течения болезни и клинического исхода, выявление генов и сигнальных путей, вовлеченных в патогенез онкогематологических, и не только, заболеваний, поиск новых мишеней для направленной дифференцированной персонифицированной терапии;

· разработка и создание более простых и дешевых диагностических тестов;

· включение микрочипов в проспективные клинические исследования, подтверждение результатов анализа на микрочипах для внесения в клинические протоколы лечения, использование клинических протоколов с учетом новых данных о природе заболеваний. [13]

Биочипы CQH (сравнительная геномная гибридизация) позволяет проводить одновременный анализ множества локусов генома при высоком уровне разрешения, недоступном для обычного цитогенетического анализа в короткие сроки, выявляет 99 аномалий в геноме, в том числе, трисомии - 13, 18 и 21 хромосом, что является важным для скрининга в пренатальном периоде.

Биочипы для иммунофенотипирования клеток крови используются, в основном, для диагностики гемобластозов.

Разработаны различные методики проведения анализа на биочипах на основе нанотехнологии и наноматериалов. Биочип, в данном случае, представляет собой прозрачную подложку, на которой в строго определенные участки нанесены иммобилизованные антитела (Ig G), способные взаимодействовать с определенными поверхностными антигенами клеток. Хемолюминесцентный поток определяет степень связывания, это оценивается в специальной камере с добавлением сигнального реактива и системой визуализации.

Панели определения аналитов для всех приборов достаточно широки: от гормонов (репродукции, фертильности, гормонов щитовидной железы, опухолевых маркеров) до молекул адгезии, цитокинов, лекарственных препаратов, а также ДНК–исследований (в частности – мутаций генов при колоректальном раке, раках молочной железы и легких), кардиоваскулярных заболеваний и других. Цитокины являются низкомолекулярными растворимыми белками, функционируют как сигнальные молекулы, регулирующие клетки иммунной системы, обладают аутокринной, эндокринной и паракринной функциями.

Цитокины активируются при воспалении, системном ответе и гемопоэзе, включая активацию клеточной пролиферации, миграции и инициации апоптоза, они могут проявляться при различных патологических состояниях и их концентрация может являться маркером прогноза. Кроме того, разработаны биочипы для определения антимикробной чувствительности (резистентности) к химиопрепаратам и противоспалительным продуктам.

Следует особенно отметить, что имеются в наличии биочипы для церебральной патологии. С помощью одной из панелей проводят определение деструкции астроцитов и нейродегенеративных изменений мозга, вплоть до белка, связывающего жирные кислоты. Вторая панель детектирует белки, участвующие в атеротромбозе. Широко представлена панель для определения аполипопротеинов от А до Е.

Применение биочипа облегчает и ускоряет дифференциальную диагностику формы лимфомы. Подбор препаратов, дозировок и схем лечения зависит от диагноза и группы риска пациента, определяемых на основании информации о морфологии и иммунофенотипе опухолевых клеток.

Морфологическая классификация лимфоцитов с трудом поддается формализации, а одни и те же клетки разными исследователями могут быть классифицированы как нормальные, а другими – как атипичные, что может приводить к ошибкам при постановке диагноза. Поэтому чрезвычайно актуальной является задача систематизации морфологии нормальных и патологических лимфоцитов периферической крови с использованием какой-либо дополнительной информации о наблюдаемых клетках, например, присутствие на поверхности клетки дифференцировочного поверхностного антигена. Данные проблемы позволяет решить использование клеточного биочипа. На биочипе достигается высокая, по сравнению с мазком, поверхностная концентрация клеток, что позволяет обнаруживать даже редко встречающиеся типы клеток.