Существует несколько способов изготовления биочипов.

Биочипы используют для одновременного осуществления множества однотипных исследований в небольшом количестве исследуемого материала. [8]

В качестве подложек наиболее часто применяются нитроцеллюлоза и стекло, подвергнутое различной химической модификации, полистирол, тефлон, пластиковые покровные стекла, реже золото и другие материалы. В зависимости от свойств подложки связывание белков может осуществляться следующими способами: 1) методом ковалентной пришивки; 2) методом адсорбции, который является простым и наиболее часто используемым. Белок способен адсорбироваться на любую поверхность за небольшое время (75% белка связывается с поверхностью за первые пять минут) за счет образования водородных связей, ван-дер-ваальсовых взаимодействий, электростатических взаимодействий между зарядами поверхности и заряженными участками белковой молекулы.

Методы, связанные с нанесением белков на подложку, разделяют на две группы: неконтактные (отсутствие прямого контакта с поверхностью подложки) и контактные.

К контактным методам относят:

1) Микропипетирование, при котором нанесение растворов проводится автоматической пипеткой на заранее отмеченные участки подложки. Такой способ изготовления отличается простотой, однако имеет крайне низкую производительность. Процесс ускоряется, если объединить на одном манипуляторе несколько игл.

2) Микроконтактная печать. Сначала на поверхность печати адсорбируется наносимое вещество. После прижатия печати к подложке белок переносится с выступов печати на ее поверхность. Однако процесс переноса белка плохо поддается контролю и может зависеть от индивидуальных свойств белка.

К неконтактным методам относят:

1) Микроструйное нанесение. Метод основан на пропускании наносимого вещества под давлением через микрокапилляр. При этом образуются микрокапли, которые получают электрический заряд за счет заряжающего микроэлектрода. Траектория полета капель корректируется с помощью электрического поля за счет двух пластин, к которым приложено высокое напряжение. Преимуществом метода является отсутствие прямого контакта между капилляром и поверхностью подложки.

2) Электронапыление. Мениск жидкости, помещенный в узкий капилляр, при приложении высокого напряжения деформируется, и заряженные микрокапли отрываются от него и перемещаются в сторону противоположно заряженного электрода, соединенного с электропроводящей подложкой. Отталкивание одноименных зарядов приводит к делению микрокапли на более мелкие. К недостаткам метода можно отнести неоднородность плотности нанесения вещества (максимальна в центре пятна и уменьшается по краям, что может создавать сложности при обработке результатов).

Метод фотолитографии: чипы наращивают из стеклянных пластинок с использованием микромасок. Затем полученный биочип гибридизуют с ДНК.

Есть и другой подход к изготовлению микрочипов,  когда готовые последовательности однонитевой ДНК пришивают к чипу.

 

Методы иммунной реакции, используемые биочиповой технологии:

1. анализ сэндвич на биочипе;

2. анализ с захватом антитела на биочипе;

3. конкурентный анализ на биочипе. [13]

 

Анализ сэндвич, как правило, применяют для обнаружения молекул с высокой молекулярной массой с множеством функциональных групп для связывания антитела. Антитела прикреплены к дискретным тест-областям на поверхности биочипа. Когда добавляют образец, содержащий интересующие анализируемые вещества, они связываются с областями, содержащими антитела на поверхности биочипа. Затем добавляется реактив, содержащий меченые ферментом антитела для обнаружения (конъюгат), который связывается с вторичной функциональной группой захваченного анализируемого вещества.

После добавления сигнального реактива испускается световой сигнал, который прямо пропорционален концентрации анализируемого вещества в образце пациента. Реактив с мечеными ферментом антителами содержит специфические антитела для всех дискретных тест-областей на поверхности биочипа. Для мечения антител используется пероксидаза хрена. Сигнальный реактив представляет собой универсальный субстрат, используемый для всех дискретных тест-областей на поверхности биочипа.

Анализы с захватом антител используют с целью обнаружения антител в образцах пациентов. Макромолекулы, специфичные в отношении антител, прикреплены к дискретным тест-областям на поверхности биочипа. Когда добавляется образец пациента, содержащий искомые антитела, то они связываются с макромолекулами на поверхности биочипа посредством распознавания сайтов связывания антигена. Затем, с захваченными антителами связываются меченые ферментом антитела, обладающие специфичностью в отношении антител образца. После добавления сигнального реагента, продуцируется световой сигнал, который прямо пропорционален концентрации в образце пациента. Реактив с меченными ферментом (пероксидаза хрена) антителами содержит специфические антитела для всех искомых антител, прикрепляющихся на дискретных тест-областях биочипа. Сигнальный реактив представляет собой универсальный субстрат, используемый для всех тест - областей на поверхности биочипа.

Конкурентные методы иммунологического анализа используют, как правило, для обнаружения молекул с низкой молекулярной массой, имеющих несколько функциональных групп для связывания с антителами.

Антитела прикреплены в дискретных тест-областях на поверхности биочипа, и затем добавляют анализируемое вещество, обработанное ферментом. В отсутствии образца пациента, меченое анализируемое вещество связывается с областями антител на поверхности биочипа, и после добавления сигнального реактива исходящий свет пропорционален концентрации связанного меченного анализируемого вещества (контроль). Когда же добавляют образец пациента, содержащий анализируемые вещества, последние конкурируют с мечеными веществами за сайты связывания антител. Это приводит к уменьшению количества связавшегося меченого вещества, и таким образом, будет уменьшаться исходящий световой сигнал. Исходящий световой сигнал в конкурентном анализе обратно пропорционален концентрации анализируемого вещества, присутствующего в образце пациента.

Хемилюминесценция представляет собой продуцирование света посредством химической реакции. Она используется в иммуноанализах для определения уровня анализируемого вещества в образце. В приборах с биочиповой технологией используют усиленный хемилюминесцентный субстрат с пероксидазой хрена (ПХ) в качестве метки для обнаружения антител или анализируемых веществ, связавшихся с поверхностью биочипа. Интенсивный испускаемый сигнал дает возможность для обнаружения пикограмм антитела или антигена. Механизм реакции основан на реакциях окисления и восстановления, приводящих в результате к образованию свободных радикалов и излучению света. Пероксидаза вступает в реакцию с пероксидом с образованием промежуточного раствора 1. Соединение 1 вступает в реакцию с люминолом с образованием радикала люминола, который затем распадается с испусканием света. Молекулы усилителя восстанавливают свободные радикалы, что способствует реакции хемилюминесценции.

Затем для количественного определения сигнала используется процесс визуализации, управляемый программным обеспечением.

 

 

Заключение

 

  В настоящее время направление биосенсорной технологии оказалось очень перспективным. Интерес к биочипам и биосенсорам растет. Они получили большое распространение в биотехнологии. 

Приведенные в реферате примеры свидетельствуют в пользу того, что в ближайшее время технология биочипов и биосенсоров будет стремительно развиваться, а их массовое производство приведет к резкому уменьшению стоимости этой продукции. Сейчас число размещаемых на биочипе ячеек достигает уже нескольких тысяч, что соответствует тысячам пробирок с проводимыми в них анализами. Такие биочипы представляют собой целые экспресс-лаборатории, которые позволяют сэкономить массу времени как врачам, так и пациентам. Развитие технологии использования биочипов и биосенсоров не только приведет к резкому сокращению сроков проведения анализов, но и даст возможность осуществлять диагностику на индивидуальном уровне.

 

 

Список литературы

 

1. Y.V. Stebunov, O.A. Afteneva, A.V. Arsenin, V.S. Volkov, Highly sensitive and selective sensor chips with graphene-oxide linking layer // ACS Applied Materials & Interfaces.

2. Z Tehrani, G Burwell, M A Mohd Azmi, A Castaing, R Rickman, J Almarashi, P Dunstan, A Miran Beigi, S H Doak, O J Guy. Generic epitaxial graphene biosensors for ultrasensitive detection of cancer risk biomarker. 2D Materials, 2014

3. Е. Рябцева. Технологии биотехнологии: белковая инженерия, нанобиотехнология, биосенсоры и биочипы. Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология» http://www.cbio.ru/ по материалам BIO.org.

4. И. Н. Курочкин, Нанобиоаналитические системы: от молекулярного узнавания до биодетекции. 2012