Методы культивирования микроорганизмов.

Культивирование продуцентов в промышленных условиях принято называть ферментацией. В зави-симости от классификационного признака различают следующие типы ферментационных процессов:

• по отношению микроорганизмов продуцентов к кислороду: аэробные и анаэробные;

• по локализации продуцентов в питательной среде: глубинные и поверхностные;

• по условиям проведения процесса: периодические, полунепрерывные (отъемно-доливные, с под-питкой); непрерывные.

Глубинный метод культивирования продуцентов ферментов

Глубинный метод культивирования заключается в выращивании микроорганизмов в жидкой питательной среде. Он технически более соверше­нен, чем поверхностный, так как легко поддается механизации и автоматизации.

Весь процесс должен проводиться в строго асептических условиях, что с одной стороны, является преимуществом метода, а с другой - составляет наи­большую техническую трудность, т.к. нарушение асептики часто приводит к прекращению образования фермента.

Концентрация фермента в среде при глубинном культивировании обыч­но значительно ниже, чем в водных экстрактах поверхностной культуры. Фильт­раты культуральных жидкостей содержат не более 3% сухих веществ. Это вызы­вает необходимость предварительного концентрирования фильтратов перед тем, как выделять ферменты любым методом.

Культивирование аэробных микроорганизмов проводят следующим образом:

на поверхности плотных сред или в тонком слое жидких сред, когда микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха;

в жидких средах (глубинное культивирование). В этом случае микроорганизмы используют растворенный в среде кислород. В связи с низкой растворимостью кислорода, для обеспечения роста аэробных бактерий в толще среды, требуется постоянное аэрирование.

Культивирование анаэробных микроорганизмов более сложно, чем выращивание аэробов, так как здесь должен быть сведен до минимума контакт микроорганизмов с молекулярным кислородом. Для создания анаэробных условий используют различные приемы. Их подразделяют на физические, химические и биологические. Все они основаны на том, что микроорганизмы культивируют в каком-то замкнутом пространстве.

Поверхностный метод культивирования продуцентов ферментов

Культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды. Мицелий полностью обволакивает и прочно скрепляет твердые части­цы, клетки получают питание за счет содержащихся в этих средах веществ и ис­пользуют для дыхания кислород воздуха, поэтому для их нормального обеспече­ния кислородом приходится применять рыхлые по своей структуре среды с не­большой высотой слоя.

Недостатком метода является необходимость больших площадей для вы­ращивания. Выращивание производственной культуры происходит обычно в не­асептических условиях. Однако среда и кюветы должны быть надежно стерили­зованы. Перед новой загрузкой должны дезинфицироваться растильные камеры, а также все мелкое оборудование и инвентарь.

Главное преимущество поверхностного метода - более высокая конечная концентрация фермента на единицу массы среды. Например, для осахаривания 100 кг крахмала в спиртовом производстве требуется 5 кг поверхностной культу­ры плесневых грибов или около 100 кг культуральной жидкости. Поверхностные культуры можно быстро и легко высушить, их легко перевести в товарную фор­му и транспортировать. Меньше потребность электроэнергии по сравнению с глубинным методом.

епрерывное культивирование перспективное. Его сущность заключается в том, что в ферментаторе поддерживаются постоянные условия среды, в результате чего микроорганизмы остаются в определенном физиологическом состоянии. Подается свежая питательная среда и удаляется избыток среды с продуктами метаболизма, поддерживается фаза экспоненциального роста.

Если для культивирования продуцента используется один ферментатор, то говорят о гомогенно-непрерывном процессе. Если же используется батарея, то это гетеро-непрерывный процесс, так как в каждом ферментаторе, соединенном в батарею, поддерживаются постоянные условия.

При непрерывном культивировании микроорганизмов отсутствует смена фаз развития культуры. В таких процессах скорость потока питательной среды и отвода культуральной жидкости из системы необходимо отрегулировать, чтобы концентрация клеток оставалась постоянной. В стерильных условиях непрерывный метод обеспечивает сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительное время.

Поддержание динамики равновесия в реакторе осуществляется двумя методами: турбидостатным и хемостатным.

Периодическое культивирование микроорганизмов. В периодическом состоянии динамика роста и размножения микроорганизмов в жидкой питательной среде обладает рядом особенностей, общих для бактерий, актиномицетов, микроскопических грибов, микоплазм.

При индивидуальном развитии им свойственна высокая скорость размножения. Развитие происходит в виде последовательных фаз, характер и продолжительность которых зависят от физиологического состояния клеток, определяемого, в свою очередь, условиями разнообразных факторов среды, в которой развивается популяция того или иного организма.

Другими словами, фазы роста микроорганизма отражают количественные и качественные изменения в их биомассе и окружающей среде. В простой гомогенной периодической культуре микроорганизмов выделяют от 4 до 8 и даже до 16 фаз. Рост микробной популяции изображают обычно графиками, откладывая на оси абсцисс время роста, а на оси ординат - число микробных клеток

а) исходная фаза (лаг-фаза или инукционный период) является фазой задержки роста, когда размножение микробных клеток не происходит.

Данная фаза характеризуется отсутствием роста клеток. В этот период посевная культура приспосабливается к изменившимся внешним условиям и вырабатывает ферменты, необходимые для роста на данной питательной среде. В лаг-фазе в клетках культуры происходят значительные качественные изменения: возрастает количество нуклеиновых кислот, в первую очередь РНК, активизируются одни ферменты и синтезируются другие. Продолжительность лаг-фазы зависит от следующих факторов:

- от состава питательной среды: если питательная среда по составу мало отличается от среды, на которой росла посевная культура, лаг-фаза может практически отсутствовать;

- от качества посевного материала, а именно, количества в нем жизнеспособных клеток, их возраста, способа хранения;

- от посевной дозы.

б) период положительного ускорения роста.

Длительность этого периода для большинства микроорганизмов составляет 2 часа и зависит от температуры, состава питательной среды, качества посевного материала. Многие авторы эти две фазы рассматривают вместе. Число клеток остается постоянным по причине отсутствия в этот период клеточного деления. Общее состояние микробных клеток характеризуется как состояние приспособления к питательной среде. В этот период усиливается синтез вещества, клеток, они увеличиваются в размере, в них образуется большое количество индуцибельных ферментов.

в) фаза логарифмического (лог-фаза), или экспоненциального (показательного), роста.

Она характеризуется постоянной и максимальной скоростью роста клеток. Рост микробов в эту фазу происходит в геометрической прогрессии. Продолжительность этой фазы зависит:

- от запасов питательных веществ в среде;

- от условий аэрации;

- от перемешивания и др. факторов.

Для описания процессов роста микроорганизмов используют такие характеристики, как общая и удельная скорости роста биомассы (или числа клеток). Другой важной характеристикой роста культуры является время генерации, за которое биомасса культуры удваивается. Время генерации из разных культур микроорганизмов сильно различается. Наиболее быстрорастущие бактерии при благоприятных условиях имеют период генерации - 20-25 мин. Продолжительность генерации в лог-фазе у разных микроорганизмов неодинакова. Так, для сальмонелл она равна 20-30 мин., для стрептококков и стафилококков - 25-35 мин., для эшерихий - 15-17 мин. На продолжительность генерации влияют температура, рН среды, состав среды и т.д. Высокая скорость развития микроорганизмов сохраняется на всей экспоненциальной стадии. Однако эта зависимость наблюдается в течение ограниченного времени. По мере роста культуры в среде постепенно потребляются питательные вещества, накапливаются продукты обмена, затрудняется транспорт питательных веществ (в первую очередь кислорода) и метаболитов вследствие увеличения плотности популяции.

г) фаза отрицательного ускорения.

В эту фазу скорость размножения замедляется, а время генерации увеличивается. Наступление данной фазы обусловлено истощением питательной среды и накоплением в культуральной жидкости токсических веществ, которые начинают ингибировать развитие культуры. Кроме того, в эту фазу происходит наивысшее накопление микробной массы в единице объема.

д) стационарная фаза роста, или максимума, на протяжении которой численность микробной популяции не уменьшается.

В эту фазу скорость размножения и отмирания клеток одинаковая. Концентрация живых клеток в данную фазу достигает максимума, и она называется М-концентрацией. В этой фазе сама биомасса микроорганизмов и продуктов их биосинтеза обладает наибольшей биотехнологической ценностью.

е) фаза отмирания микробной популяции.

21. Первичные и вторичные метаболиты. Особенности образования.

См 3 и 4