Лекция 4. Получение культур микроорганизмов, выращенных поверхностным и глубинным способом культивирования.

Вопросы. 1.Условия культивирования микроорганизмов поверхностным способом на твердых и жидких средах. Приготовление посевного материала. Последовательность технологических операций.

2. Условия культивирования глубинным способом. Принципиальная схема процесса. Подготовка воздуха для аэрирования глубинной культуры.

3. Сырьевая база промышленной биотехнологии и принципы приготовления питательных сред. Основные технологические приемы регуляции процессов микробного синтеза.

Поверхностный метод культивирования продуцентов ферментов. Культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды. Мицелий полностью обволакивает и прочно скрепляет твердые частицы, клетки получают питание за счет содержащихся в этих средах веществ и используют для дыхания кислород воздуха, поэтому для их нормального обеспечения кислородом приходится применять рыхлые по своей структуре среды с небольшой высотой слоя.

Недостатком метода является необходимость больших площадей для выращивания. Выращивание производственной культуры происходит обычно в неасептических условиях. Однако среда и кюветы должны быть надежно стерилизованы. Перед новой загрузкой должны дезинфицироваться растильные камеры, а также все мелкое оборудование и инвентарь.

Главное преимущество поверхностного метода - более высокая конечная концентрация фермента на единицу массы среды. Например, для осахаривания 100 кг крахмала в спиртовом производстве требуется 5 кг поверхностной культуры плесневых грибов или около 100 кг культуральной жидкости. Поверхностные культуры можно быстро и легко высушить, их легко перевести в товарную форму и транспортировать. Меньше потребность электроэнергии по сравнению с глубинным методом.

Посевной материал. Может быть в виде культуры, выращенной на твердой питательной среде, спорового материала или мицелиальной массы продуцента, выращенной глубинным методом. Посевную культуру получают выращиванием микроорганизмов во все возрастающем количестве в 3 или 4 этапа.

Исходную музейную культуру продуцента, находящуюся на твердой агаризованной среде, пересевают сначала на 1-1,5 г увлажненный стерильных пшеничных отрубей в пробирку. Выращивание проводят в термостате до обильного спорообразования. Второй этап осуществляют на той же среде и при тех же условиях, но в колбах, содержащих до 100 г рыхлой среды. Третий этап - выращивание в сосудах на 500 г среды. На четвертом - выращивание ведут в посевных кюветах, если материал нужен в виде культуры, или отделяют конидии от основной массы мицелия и субстрата на специальном вибросепараторе, если необходимы споры. Выращивание проводят также в инокуляторе объемом 8-10 л на жидкой питательной среде, если инокулят нужен в виде мицелиальной массы.

Можно продлить срок хранения посевного материала, если спороносящую культуру подсушить до влажности 10-12 %, отдельные конидии поместить в герметичную тару, а мицелиальную массу охладить до 4-6 ⁰ С.

Приготовление питательных сред. Основой являются пшеничные отруби. В увлажненном состоянии отруби создают требуемую структуру среды, добавляют свекловичный жом, богатый пектином и целлюлозой, соевый шрот для повышения содержания белков и индукции протеазы, соевую муку или другие, включающие жиры материалы для индукции липазы, пивные отходы, обогащенные крахмалом, для стимулирования биосинтеза амилолитического комплекса и др.

Дополнительное введение в отруби растительных отходов - овсяной или рисовой шелухи, соломы, кукурузных кочерыжек и древесных опилок.

Стерилизация питательных сред и засев. Питательную среду готовят в специальных емкостях или непосредственно в стерилизаторе. Сначала смешивают нужные компоненты, затем их увлажняют, подкисляют соляной кислотой для лучшей стерилизации, добавляют минеральные источники азота и фосфора и подают на стерилизацию.

Прогрев сыпучих смесей осуществляют острым паром в цилиндрических аппаратах при постоянном перемешивании. Время выдержки среды при температуре стерилизации (105-140⁰ С) больше, чем для жидкостей, так как труднее обеспечить полный проггрев. Обычно для этого требуется 60-90 минут. После стерилизации среда охлаждается в этом же аппарате продуванием стерильного холодного воздуха или водой, подаваемой в рубашки. После снижения температуры до 38-40 ⁰С в аппарат вводят посевную культуру продуцента, при этом также производят тщательное перемешивание среды.

Большая доза посевного материала уменьшает длительность начальной фазы, Такая культура начинает обильно спороносить, что осложняет дальнейшую переработку. Поэтому доза посевного материала должна быть минимально возможной, обычно 0,02-0,1 % от массы среды. В заводских условиях из-за неполной стерилизации вносят 0,5-1,0 % посевного материала.

Засеянная среда поступает из стерилизатора на специальный стол и раскладывается ровным слоем на простерилизованные кюветы. Обычно эта операция производится вручную и требует сноровки и быстроты, так как нельзя допускать переохлаждения среды ниже 28-30 ⁰С, чтобы не замедлить начальный рост культуры. Затем заполненные кюветы устанавливают на этажерки, которые сразу же задвигают в растильные камеры.

Производственное культивирование. Процесс выращивания поверхностной культуры длится 36-48 часов. Весь цикл роста можно разделить на три периода:

- В течение первых 10-12 часов происходит набухание конидий и их прорастание; в этот момент температура не должна быть ниже 28 ⁰С.

- В следующие 12-18 часов происходит быстрый рост мицелия, его можно наблюдать в виде пушистого налета серовато-белого цвета. Клетки потребляют основное количество питательных веществ, очень энергично дышат и выделяют большое количество тепла, которое необходимо отводить.

- Третий период продолжается 12-18 часов. Процессы обмена ослабевают, тепла выделяется меньше, но образование фермента все еще происходит, а у большинства видов аспергиллов начинается образование конидий.

Выращивание культуры происходит в кюветах, их помещают на этажерки, а последние – в растильные камеры (700 кг). Более современен способ выращивания культуры в вертикальных кассетах. В камере 23 кассеты в них, загружается до 500 кг среды.

Измельчение и сушка культуры. Выросшая культура в виде сухого коржа, который размельчают до гранул 5-6 мм. Применяют дробилки: дезинтеграторы, барабанно-зубчатые, ударного действия, шнековые и молотковые.

После дробления культуру, имеющую влажность 40-50 %, необходимо высушить до 10-12 %, чтобы предотвратить инактивацию ферментов. Температура сушки не должна превышать 40 ⁰С, а длительность не более 30 минут. На заводах используют конвективные сушилки ленточного, тоннельного, барабанного, шахтного и других типов. Порошок упаковывают в крафт мешки по 15-30 кг, снабжают этикеткой с указанием препарата и его активности и отправляют потребителю.

Для выращивания микроорганизмов могут использоваться различные виды сырья: отходы древесного и сельскохозяйственного растительного сырья, сульфитные щелоки, жидкие и газообразные углеводороды, метиловый и этиловый спирты, отходы сельского хозяйства, пищевой, рыбной и мясоперерабатывающей промышленности. К используемым отходам сельского хозяйства, плодо- и лесоперерабатывающей промышленности относятся: хлопковая и рисовая шелуха, кукурузная кочерыжка, подсолнечная лузга, гуза-пай, солома, багасса, оболочка какао-бобов, скорлупа кокосовых орехов, кожура фруктов, овощей, листья, жмых, мякина, выжимка плодов и овощей, капустная и картофельная мезга, навоз, кора, хвоя, опилки, древесное волокно, листья, щепа, ветки, обрезки древесины, городские отходы, старая бумага, картон, сточные воды.

Различный состав сырья, неодинаковые количественные и качественные характеристики источников углерода, азота и других необходимых для жизнедеятельности микроорганизмов соединений дают разный выход биомассы микроорганизмов из 1 кг абсолютно сухого сырья (в кг): отходы древесного и сельскохозяйственного сырья 0,18-0,22, сульфитные щелоки 0,01-0,02, н-парафины 0,80-1,00, газообразные углеводороды 0,80-1,00, метанол 0,40-0,45, этанол 0,45-0,50, свекловичная меласса 0,22-0,26, молочная сыворотка 0,02-0,03.

Предварительная обработка зерна. При использовании для приготовления питательных сред большинства перечисленных источников сырья, особенно гидролизатов древесины, сульфитных щелоков, различных видов углеводородного сырья необходимо вносить в среду дополнительно микроэлементы, азотное и фосфорное питание, витамины. Для этого используют кукурузный экстракт, дрожжевые автолизаты и гидролизаты, отходы производства витаминов, лимонной кислоты и др. В состав сред вводят минеральные соли, содержащие азот, фосфор, калий, магний и другие элементы. Источником азота в среде может быть аммиак, который поддерживает рН на определенном уровне.

Решающее значение для проведения биотехнологических процессов имеет химический и биологический состав воды. Вода не должна содержать токсических загрязнений, вирусов, плазмид и спор.

В процессе подготовки питательных сред важное значение имеет смешивание и стабилизация готовой реакционной среды. Подготовка питательных сред сопряжена с использованием различных методов ее обработки: физико-механических (измельчение компонентов, гомогенизация, перемешивание, растворение, фильтрация, тепловая обработка); химических (регулирование окислительно-восстановительного потенциала, рН среды, ионной силы, осмотического давления, гидролиз, нейтрализация); биологических (оценка среды на стерильность, предварительное культивирование на среде, ферментативный гидролиз, изомеризация и т.п.).

Готовые среды могут не требовать стерилизации, и после приготовления на них можно культивировать микроорганизмы. В некоторых случаях питательные среды необходимо стерилизовать, что можно осуществить путем нагрева, озонирования, стерилизующей фильтрации, хлорирования, обработки формалином или облучения.

Глубинный метод культивирования заключается в выращивании микроорганизмов в жидкой питательной среде. Он технически более совершенен, чем поверхностный, так как легко поддается механизации и автоматизации. Весь процесс должен проводиться в строго асептических условиях, что с одной стороны, является преимуществом метода, нарушение асептики часто приводит к прекращению образования фермента.

Концентрация фермента в середе при глубинном культивировании обычно значительно ниже, чем в водных экстрактах поверхностной культуры. Фильтраты культуральных жидкостей содержат не более 3 % сухих веществ. Это вызывает необходимость предварительного концентрирования фильтратов перед тем, как выделять ферменты любым методом.

Технологические схемы при глубинном способе культивирования почти не отличаются одна от другой, независимо от среды и продуцента. Исключение представляют те редкие случаи культивирования анаэробных микроорганизмов, в которых опускается стадия подготовки воздуха.

Получение посевного материала. Готовят также глубинным способом. Вид посевного материала зависит от продуцента: для грибов и актиномицетов - мицелиальная вегетативная масса, а для бактерий - молодая растущая культура на начальной стадии спорообразования. П остадийное увеличение массы продуцента в четыре ступени: - исходная культура продуцента; - маточная культура, выращенная в колбах на качалке; - посевная культура, выращенная в инокуляторе; - посевная культура, выращенная в посевном аппарате.

Объем посевного материала зависит от физических особенностей продуцента. Он резко возрастает, до 5-20 %, если продуцент размножается только вегетативно, и сокращается до 1 %, если происходит обильное спороношение. Объем посевного аппарата составляет до 10 % от объема промышленного ферментера. При использовании слишком молодой посевной культуры процесс затягивается.

Участок приготовления среды изолируют от других производственных помещений, чтобы загрязненное микроорганизмами сырье не попало в основное производство. На предприятии среды готовят централизованно в отдельном здании.

Методы приготовления питательных сред зависят от состава компонентов. Для некоторых требуется предварительная обработка: измельчение, отваривание, экстрагирование, гидролитическое расщепление. Затем готовые к растворению компоненты подают при постоянном перемешивании через дозирующие устройства в емкость для приготовления среды. Необходимо соблюдать последовательность введения в смесь отдельных компонентов. Емкости и аппараты должны быть антикоррозионными. Передачу жидких потоков осуществляют насосами, самотеком или продавливанием сжатым воздухом.

В отделении приготовления сред должны быть смесители с мешалками и барботерами, теплообменники, дозаторы, размельчители, экстракторы, варочные котлы, аппараты для ферментативного гидролиза.

Стерилизацию питательных сред можно производить периодически и непрерывно. В первом случае процесс ведут в самом ферментере, куда заливают питательную среду, нагревают ее до температуры стерилизации, выдерживают при этой температуре нужное время и охлаждают. Во втором случае предварительно стерилизуют аппараты и коммуникации проточным паром, затем подают в ферментер среду, которая прошла через нагревательную колонку, где нагрелась острым паром до 120-140⁰ С, выдерживатель, где находилась нужное время под температурой стерилизации и холодильник, где охладилась до температуры культиивирования.

Очистка воздуха до и после аэрирования. Необходима двойная очистка - на головном фильтре, затем на индивидуальных фильтрах непосредственно перед вводом воздуха в посевные и производственные ферментеры. После аэрирования производственной культуры газовый поток, отводимый из ферментера, несет с собой клетки продуцента. Их отлавливают фильтрами на отводящем воздуховоде.

Производственное культивирование. Биосинтез ферментов протекает в течение 2-4 суток при непрерывной подаче воздуха и перемешивании.

Большинство ферментов выделяются в окружающую клетки жидкую среду. В мицелии трехсуточной культуры остается не более 10-15 % ферментов. В этом случае препараты ферментов выделяют из фильтратов после отделения биомассы. Иногда ферменты остаются в клетках и могут быть извлечены после разрушения клеток и их обработки. Ппитательная среда вводится в ферментер постепенно на стадии активного роста.

Биореактор, ферментер или ферментатор - это закрытая или открытая емкость, в которой при определенных условиях (давление, температура, концентрация сухих веществ, pH среды и т.д.) протекает на клеточном или молекулярном уровне контролируемая реакция, осуществляемая с помощью микроорганизмов.

Основное назначение ферментера - своевременно обеспечить микробную клетку необходимыми питательными веществами и кислородом и отвести продукты обмена веществ, создать однородный состав среды при условии слабой турбулентности потока.

В водной среде ферментера путем добавления и отбора регулируют степень перемешивания, транспорт веществ к клетке, концентрацию субстрата, кислорода, витаминов, минеральных и вспомогательных веществ, температуру и давление.

Для поддержания необходимого кислородного режима ферментер снабжают устройством подвода воздуха, для лучшего перемешивания среды - мешалками различной конструкции. В процессе роста микроорганизма выделяется 10-14 кДж теплоты на 1 кг сухой массы дрожжей. Для отвода избыточного количества теплоты и поддержания температуры среды на оптимальном уровне в ферментаторах предусмотрены различные системы охлаждения: змеевики вдоль стен внутри аппарата, выносные теплообменники и др.

Классификация ферментационных систем. Конструкции промышленных ферментеров отличаются большим разнообразием в зависимости от специфических свойств субстратов, морфологических и физиологических особенностей культивируемых микроорганизмов, способов культивирования, систем подачи воздуха, перемешивания, подвода энергии, отвода теплоты.

Контрольные вопросы

1. Достоинства и недостатки поверхностного и глубинного способов культивирования. Сходство и отличие этих способов.

2. Производственное культивирование, оборудование и технологические параметры.

3. Какие принципы культивирования соблюдаются в этих процессах.

Литература

1. Биотехнология: Учебное пособие для вузов в 8 книгах. Под ред. Егорова Н. С., Самуилова В. М. – М: Высшая школа, 1987. С. 1 – 1194.

2. Грачева И. М., Иванова Л. А., Кантере В. М. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и биоэнергия. М., Колос, 1992. С. 1 – 383

3. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. М., Колос, 1999 г. С. 1 – 380.

 

Лекция 6.