Стерилизация технологических потоков

СТЕРИЛИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПОТОКОВ

 

Цель работы:

1. Получение стерильной жидкости требуемого уровня стерилизации по следующим условиям:

- температура стерилизации до 170 °С;

- изотермическое выдерживание процесса стерилизации от 20 минут;

- производительность до 100 л/час.

2. Получение перегретого пара при нормальной температуре 160 °С, получение более высоких температур до 200 °С.

3. Получение перегретого пара по устойчивости кклиматическим воздействиям.

Краткие теоретические сведения

Методы стерилизации

 

Уничтожение микроорганизмов - один из необходимых элементов в биотехнологических и микробиологических производствах. Освобождение какого-либо материала от живых микроорганизмов или их покоящихся форм называют обеспложиванием или стерилизацией Стерилизация - это полное обезвреживание объектов, принадлежностей, посуды, инструментов, использованных при исследовании материалов, рабочего места и т.д.

От стерилизации следует отличать частичное обеспложивание (пастеризацию), а также консервирование. Если стерильная среда или микробная культура загрязняется случайно попавшими в нее микроорганизмами, то говорят о контаминации, или загрязнении. Такие понятия, как дезинфекция (уничтожение всех патогенных микроорганизмов), асептика и антисептика, а также инфекция, употребляются главным образом в гигиене, а не в микробиологии и биотехнологии.

Микроорганизмы проявляют разную чувствительность к средствам, применяемым для их уничтожения. Существуют видовые различия в чувствительности, а также различия, зависящие от влажности и рН среды, от возраста вегетативных клеток или спор и т.д. Эффективность различных агентов, применяемых для уничтожения микроорганизмов, характеризуют величиной D₁₀(время, необходимое для того, чтобы в определенной популяции при определенных условиях среды вызвать гибель 90% клеток Полная или частичная стерилизация осуществляется с помощью влажного жара, сухого жара, фильтрации, облучения или различных химических средств.

Различают физические и химические методы стерилизации.

Физические методы

Стерилизация сухим жаром производится в сушильных шкафах следующих марок: СНОЛ-3,5.3,5.3,5/3 м; ШС-40, ПЭ-4610 и др.

 

Рис. 1. Сушильный шкаф ПЭ-4610

При стерилизации сухим жаром бактериальные споры переносят более высокие температуры и притом дольше, чем при стерилизации влажным жаром. Этот способ применяется в основном для обработки посуды, сухих материалов и т.п. Перед стерилизацией посуду заворачивают в бумагу, а сухие продукты - в пакеты. Затем все укладывают на сетку сушильного шкафа так, чтобы не было касания его стенок. Стерилизацию проводят при 180 °С в течение одного часа или в течение 2 часов при 160°С. Вынимают посуду и инструменты после снижения температуры в шкафу до комнатной температуры.. В случае стерилизации материалов с высокой теплоемкостью или термоизоляционными свойствами следует учитывать время прогрева. В любом случае рекомендуется контролировать температуру с помощью индикаторов или проверять полноту стерилизации. В настоящее время применяют 30-минутный нагрев при 180С. Стерилизация жаром основана на коагуляции клеточных белков.

Кипячение. Этот метод используют дня стерилизации шприцев, инструментов, стеклянной и металлической посуды. Стерилизатор, где производят обработку инструментов и посуды, перед загрузкой тщательно моют и ополаскивают дистиллированной водой. Также моют стерилизуемые принадлежности. Кипячение производят 40 минут. Для достижения полной стерилизации от спор бактерий шприцы и иглы стерилизуют с добавлением 1% соды Na₂CO₃.

Фильтрование через мелкопористые фил ьтры (холодная стерилизация) применяется для стерилизации жидкостей, в состав которых входят органические соединения, претерпевающие изменения (разложение) при нагревании (сыворотка и т.п.), растворы, содержащие термолабильные вещества. Освобождают эти жидкости от микроорганизмов путем пропускания растворов через стерильные мелкопористые фильтры (мембранные ультрафильтры, асбестовые, глиняные фильтры). В практике холодной стерилизации наибольшее распространение получило фильтрование через ультрафильтры.

Неглазурованные фарфоровые цилиндры (свечи Шамберлана) применялись уже в лаборатории Пастеpa. В лабораториях и для стерилизации питьевой воды используют фильтры Беркефельда (из прессованного кизельгура). Часто употребляют также асбестовые пластинки (в фильтрах Зейца), стеклянные фильтры и мембранные фильтры. Некоторые из них выпускаются с различной величиной пор, что позволяет даже разделять организмы разной величины и формы. Различают фильтры №1,2, 3, 4, 5 и 6. Для стерилизации жидкостей от микроорганизмов используют фильтры № 1-4 с размерами пор 0,3-1,0 мкм. Перед использованием фильтры кипятят в течение 30 минут, меняя 2-3 раза воду. Фильтрование проводят в фильтре Зейтца, вмонтированном в колбу Бунзена (рис.2).

Рис. 2. Прибор Зейтца с воронкой

 

Стерилизация текучим паром (дробная стерилизация). Текучим паром стерилизуют воду, питательные среды, содержащие молоко, солод, желатину, углеводы, резиновые трубки и другие предметы, которые портятся под действием высокой температуры. Стерилизацию по этому методу проводят в аппарате Коха или в автоклаве с незавинченой крышкой и открытым паровыпускным краном. Время, необходимое для обеспложивания загруженных предметов (30 минут), отсчитывают с момента выхода непрерывной струи пара, когда температура в аппарате или автоклаве достигает 100°С. Однократная обработка текучим паром полностью не уничтожает споры бактерий. Полная стерилизация достигается лишь при повторной обработке текучим паром - дробной стерилизации. При этом материалы и среды стерилизуют в течение трех дней по 30 минут. В промежутках стерилизуемые предметы хранят в шкафу при комнатной температуре. За этот срок споры микроорганизмов должны прорасти в вегетативные формы, которые уничтожаются последующей стерилизацией текучим паром.

Стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование). Это наиболее надежный способ стерилизации, позволяющий уничтожить все виды микроорганизмов и даже наиболее устойчивые споры. Производят ее в герметически закрывающемся толстостенном котле - автоклаве, в котором стерилизуемые объекты нагревают сухим паром при давлении выше атмосферного.

Рис.3 Автоклав.

 

Обычно в автоклаве стерилизуют под давлением 1 атм., что соответствует 119-120°. Питательные среды стерилизуют под давлением 0,5 атм от15 до 30 минут, аппараты, ферментеры стерилизуют при давлением 1атм 1-2 часа. Стерилизацию объектов ведут следующим образом. В автоклав наливают воду, погружают стерилизуемые объекты в свободный сосуд, завинчивают крышку и включают нагреватель. При этом выпускной кран оставляют открытым до выхода непрерывного горячего сухого пара. Затем кран закрывают, доводят давление до 1 атм. и поддерживают его на этом уровне в течение 20 минут (в современных автоклавах давление поддерживается автоматически). После этого нагревание прекращают путем обесточивания энергии и ждут, пока стрелка манометра дойдет до нуля. Затем выпускной кран ставят в положение "открыто", спускают пар и открывают крышку автоклава. Полезно при полуоткрытой крышке оставить предметы в автоклаве на несколько минут для осушки.

Облучение - Стерилизация ультрафиолетовым облучением. Для полной или частичной стерилизации применяют ультрафиолетовые, рентгеновские и гамма-лучи. В лабораторных условиях наибольшее значение имеют ультрафиолетовые лучи. В качестве стерилизатора при этом методе используют бактерицидные лампы, имеющие форму трубки диаметром 15-20 мм с оксидными электродами на концах. Под действием электрического тока ртутные пары, закачанные во внутрь, в лампах дают яркий зеленовато-белый свет, богатый ультрафиолетовыми лучами. В спектре УФ-ламп преобладает излучение в области 260 нм, поглощаемое главным образом нуклеиновыми кислотами и при достаточно длительном действии вызывающее гибель всех бактерий. Суть действия этих лучей сводится к тому, что они воздействуют на белковые молекулы и ферменты цитоплазмы клеток и уничтожают их.

Бактерицидные лампы типа БУВ-15 и БУВ-30 используются для стерилизации воздуха, воды, стен, пола, потолка боксов и исследовательской лаборатории, поверхности различных предметов и оборудования при этом бактерии погибают очень быстро, а споры грибов гораздо менее чувствительные к ультрафиолету, - значительно медленнее.

Прокаливание на огне - наиболее быстрый и надежный метод обработки (стерилизации) негорящих предметов (платиновые петли, иглы, мелкий инструмент, пипетки, предметные и покровные стекла, палочки стеклянные и т.п.). Прокаливают предметы на пламени спиртовки (петли и иглы нагревают докрасна, а предметные и покровные стекла, скальпели, пинцеты, шпатели, палочки несколько раз проносят через пламя). Данные работы выполняются в боксе.

Химические методы

Консервация - этот метод применяется для предупреждения бактериального загрязнения отдельных питательных сред путем ввода в них хлороформа (0,1-0,5%), фенола (0,25-0,5%), формалина (0,05%), толуола (0,1-0,5%) и т.д. Перед применением среды нагревают на водяной бане при 56° для освобождения их от консерванта.

 

Таблица 2 Дезинфицирующие растворы дли обработки ими предметов

Наименование	Содер-	Объект обработки	Примечание
	жание
	вещест
	ва, %
Раствор	1-5	Пипетки, палочки, шпатели,	При загрязнении
хлорамина		предметные и покровные стекла,	инфекциями используют
		пробки резиновые, или	активированный.
		каучуковые, халаты.	подогретый до 40-45°.
		Металлические инструменты.	Время обработки - 0,5-5ч
Раствор фенола	3-5	Пипетки, палочки,	Время обработки
(карболовая		предметные и покровные стекла.	0,5-1,0 ч.
кислота)
Мыльно-	3-5	Пипетки, палочки, шпатели,	Время обработки
карболовый		предметные и покровные стекла,	0,5-10,0 ч.
раствор		скальпели, пинцеты, перчатки
		каучуковые трубки и т. д.
Раствор	2	-II-	Время обработки
гипохлорида			1,0-2,0 ч.
кальция (натрия)
Раствор виркона	0,8-1,5	-II-	Время обработки 1,0ч.
Осветленный	0,2	Пипетки, палочки, предметные	Время обработки
Раствор хлорной	-10	и покровные стекла	0,5-1,5 ч.
извести
Спирт	70	Пипетки, палочки, предметные	Время обработки
		и покровные стекла, скальпели	5-10 мин.
		пинцеты ит.д.

 

.

Оборудование и материалы:

- автоклав вертикальный или автоклав горизонтальный, стерилизатор медицинский, фильтр Зейтца, вакуумный насос, сушильный шкаф суховоздушный электрический, бактерицидная лампа переносная, бактерицидная лампа стационарная, спиртовка;

- чашки, колба коническая 100-250 см³, колба круглодонная 250-1000 см³, пипетки 1-10 см³ пробирки 10-20 см³, стеклянные сосуды или емкости 1000-2000 см³, стеклянные палочки, предметные и покровные стекла, резиновые перчатки, прорезиненный фартук, металлические инструменты - пинцет, шпатель, бактериальная петля;

- вата, марля, бумага, нитки, мембранные фильтры "Владипор" №1, №3. ультрафильтры (гемицеллюлозные) №1-№3, асбестовые фильтры, фильтровальная и оберточная бумага;

- фенол, формальдегид, хлороформ, толуол, хлорамин, мыло хозяйственное, хлорная известь, 70%-ый раствор этилового спирта.

До применения оборудования для стерилизации посуды и материалов необходимо ознакомится с порядком и правилами работы сушильного шкафа, автоклава, стерилизатора, бактерицидной лампы и др.

Согласно прописи надо подобрать необходимую посуду, химические реактивы; т.е. берут расчетное количество навесок химреактивов, производят растворение их в дистиллированной или водопроводной воде, объем доводят в мерной колбе или мерных цилиндрах до метки, затем разливают в склянки, закрывая плотно пробками. На серединном участке склянки приклеивают наклейку с указанием названия растворенного вещества

Порядок выполнения работы

 

Система стерилизации жидкой среды (рис. 2).

Вентиль подачи воды поз.7-открыт. Положение вентиля поз.9,10-закрыто.

Положение вентиля подачи жидкости поз.8 соответствует требуемой производительности установки.

Жидкость насосом поз.6 через обратный клапан и фильтр поз.26 подаётся в рекуператор поз3 по прямой подаче. В рекуператоре она принимает часть тепла посредством переноса от жидкости прошедшей нагреватель и выдерживатель и движущейся по обратной подаче.

Из рекуператора жидкость поступает в нагреватель поз.1 где посредством переноса нагревается до заданной температуры. Носителем тепла является перегретая вода. Вода получает тепло от блока тэнов управляемых по обратной связи контроллером. Применено семисторное регулирование.

Нагретая до заданной температуры жидкость поступает в выдерживатель поз.2 где она продвигаясь к рекуператору сохраняет температуру в заданных пределах.

Отдав часть тепла в рекуператоре, жидкость окончательно охлаждается до заданной температуры в радиаторе поз.4. Температура контролируется термометром поз. 18. Температура выдерживается подачей водопроводной воды. Патрубки подвода и отвода водопроводной воды обозначены соответственно поз.22и 23. Во всех агрегатах для переноса тепла использован принцип бойлера.

Температура жидкости на выходе из нагревателя контролируется термометром поз. 16 Температура воды в нагревателе подстраивается контроллером по показаниям термодатчика поз. 19

Гидроаккумулятор воды поз. 12 поддерживает давление в магистрали воды в допустимом диапазоне при отключении насоса воды поз.5 и в иных случаях предотвращает гидроудар.

Гидроаккумулятор жидкости поз.31 поддерживает давление в магистрали жидкости в допустимом диапазоне при отключении насоса жидкости, и в иных случаях предотвращает гидроудар.

Редукционный клапан поз.32 настроен под давление перегретого пара воды соответствующее заданной температуре стерилизуемой жидкости. Клапан подстраивается по показаниям термометра поз. 16

Система получения перегретого пара.

Перегретый пар получаем открытием вентиля поз. 10 Отвод пара происходит через патрубок поз.20

Парогенератор способен работать при работающей системе стерилизации так и при отсутствии процесса стерилизации жидкости.

Максимальная температура пара при неработающей системе стерилизации может быть получена настройкой контроллера.

Прогрев и очистка магистрали жидкости.

Прогрев или прочистка системы магистрали жидкости производится перегретой водой закрытием вентиля поз.8 и открытием вентиля поз.9

Указания мер безопасности.

При работе с установкой необходимо соблюдать правила техники безопасности, распространяющиеся на электрические приборы и приборы работающие под давлением и приборы с повышенным нагревом носителей тепла и нагревом поверхностей.

При монтаже следует пользоваться стандартными ключами.

Запрещается производить демонтаж агрегатов, не проверив отсутствие давления в системе, а так же при температуре жидкостей опасной для здоровья.

Не допускается применение КИП параметры, которых не соответствуют диапазону установок.

Работа в боксе.

Пересев выполняют в стерильном боксе с соблюдением следующих правил, предохраняющих культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами:

· перед началом работы бокс моют 3% раствором хлорной извести;

· обеззараживают в течение 30 минут бактерицидными лампами;

· протирают спиртом рабочий стол, пробирку с культурой, руки;

· зажигают спиртовку;

· пробирку с исходной культурой держат так, чтобы поверхность с культурой была обращена вверх и хорошо видна;

· бактериологическую петлю держат вертикально в пламени горелки и прокаливают докрасна проволоку, затем обжигают примыкающую к ней часть держателя;

· вынимают ватные пробки из пробирки. Края открытой пробирки обжигают в пламени горелки;

· осторожно вводят стерильную петлю в пробирку с культурой. Чтобы не повредить клетки петлю вначале охлаждают, прикоснувшись к внутренней поверхности пробирки или к питательной среде, свободной от микроорганизмов. Легким скользящим движением отбирают небольшое количество микробной массы. Вынимая петлю из пробирки, следят за тем, чтобы переносимый материал не касался стенок;

· снова обжигают в пламени горелки край пробирки и закрывают обожженной ватной пробкой;

· пробирку ставят в штатив. Извлеченные клетки используют для пересева на сусло-агар. Слегка касаясь петлей поверхности питательной среды, не разрыхляя ее, зигзагообразным штрихом от одного края пробирки к другому осуществляют пересев клеток культуры спиртовых дрожжей;

· края пробирки обжигают и закрывают обожженной ватной пробкой;

· оставшиеся на петле клетки, сжигают в пламени горелки;

· на пробирке делают надпись: название культуры и дата засева.

Все операции около пламени горелки проводят по возможности быстро, чтобы не загрязнять культуру посторонней микрофлорой.

Содержание лабораторной работы

 

Подготовка установки к проведению исследований

Ознакомьтесь с инструкциями по технике безопасности и охране труда, с описанием конструкции установки непрерывной стерилизации жидкой среды, автоклава, сушильного шкафа, бактерицидных ламп и принципом их работы.

Включите установку и задайте параметры отбора воды согласно выданному заданию.

 

Проведение эксперимента

Оформление и сдача отчета

 

Оформите отчет о выполненной работе, согласно представленному плану.

Отчет о работе должен содержать:

1. Схемупотока

2. Таблицу с результатами проведенных экспериментальных исследований.

3. Анализ полученных результатов и  вывод об их соответствии требованиям.

 

Отчёт

 

Название работы: ________________________________________ 

 

Цель работы: _____________________________________________ 

 

1. Отчётная таблица

 

Выводы:______________________________________________

 

Работу выполнил: _____________________________________

 

Работу принял: _______________________________________

 

«___» ____________ 20__г. 

 

Контрольные вопросы

 

Что такое стерилизация?

Какие методы стерилизации Вы знаете?

В чем заключается сущность химических методов стерилизации?

Как проводится холодная стерилизация?

Перечислите физические методы стерилизации.

Как проводится стерилизация насыщенным паром под давлением?

 

Список литературы

1. Шлегель, Г. Общая Микробиология. Москва, Мир 1987.

2. Руководство к практическим занятиям по микробиологии (под ред. Н.С. Егорова) Изд-во Московского Университета. 1995.

СТЕРИЛИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПОТОКОВ

 

Цель работы:

1. Получение стерильной жидкости требуемого уровня стерилизации по следующим условиям:

- температура стерилизации до 170 °С;

- изотермическое выдерживание процесса стерилизации от 20 минут;

- производительность до 100 л/час.

2. Получение перегретого пара при нормальной температуре 160 °С, получение более высоких температур до 200 °С.

3. Получение перегретого пара по устойчивости кклиматическим воздействиям.