Определение количества фетального гемоглобина по методу Бетке и соавторов

В основе метода лежит высокая устойчивочть HbF к воздействию щелочей. Реактивы:

1. Трансформирующий раствор - 1 г NaHC0₃; 0,2 г K₃Fe(CN_s) и 0,2 г KCN до 1 литра дистиллированной воды.

2. Денатурирующий раствор -1,2 N расттвор гидроксида натрия.

3. Осаждающий раствор - насыщенный раствор (NH₄)₂S0₄.

66

Для приготовления осаждающего раствора 500 г (NH₄)₂S0₄ растворяют в 1 л дистиллированной воды, подогревают до 70 градусов Цельсия, взбалтывают, фильтруют и охлаждают. При охлаждении в растворе выпадают кристаллы, свидетельствующие, что раствор насыщен.

Ход определения: для определения HbF 0,2 гемолизата добавляют к 3,8 мл трансформирующего раствора в пробирку № 1, которую оставляют стоять в течение 30 мин. для полного превращения НЬ в цианметтемоглобин. Затем 2,8 мл раствора цианметгемоглобина переносят в пробирку № 2 и добавляют 0,2 мл денатурирующего раствора, хорошо перемешивают и оставляют на 2 мин. Спустя 2 мин. денатурацию прерывают, добавляя 2 мл осаждающего раствора, хорошо встряхивают содержимое пробирки и через 5 минут фильтруют через двойной слой фильтра в пробирку № 3. В ней Нв F остается в растворе, который готов к фотометрированию (раствор N1 для фотометрирования).

Чтобы выяснить концентрацию общего НЬ в пробирку № 4 добавляют 0,4 мл разбавленного гемолизата из пробирки № 1 и 6,75 мл дистиллированной воды (раствор № 2 для фотометрирования). Оптическую плотность растворов № 1 и № 2 вычисляют на спектрофотометре при длине волны 540 ммк и кювете 1 см.

Относительное количество HbF вычисляют по формуле:

Показатели денситометра опыта (раствор № 1) х 100

Показатели денситометра контроля (раствор №2) х 100

Как уже указывалось выше, у здоровых взрослых людей содержание HbF равно примерно 1 -2%. При СКА содержание HbF бывает повышено - обычно 1-6% от общего количества гемоглобина, у отдельных больных -до 15%. В целом, можно констатировать, что уровень HbF в крови варьирует в значительной степени у разных индивидуумов. Результаты исследования у 100 больных, проведенного Espinosa (1976), дают возможность вывести усредненное значение содержания HbF, равное 5,7%.

ВЫЯВЛЕНИЕ ФЕТАЛЬНЫХ КЛЕТОК (F -КЛЕТКИ) В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ Необходимая аппаратура н техника.

Аппаратура. 1. Предметные стекла. 2. Водяная баня. 3. Аппарат для окраски мазков крови. 4. Микроскоп. 5. 80% спирт. 6- 0,1М раствор лимонной кислоты. 7. 0,2 М раствор Na₂HP0₄ 8. Раствор гематоксилина Гарриса. 9.0,1% раствор эозина.

67

Методика. 1. На предметное стекло нанести каплю крови больного. Быстро сделать из него тонкие мазки. В ряде случаев возникает необходимость разводить каплю физраствором 1:1.

Дать высохнуть мазкам на воздухе в течение 20 минут

2. Фиксировать мазки 80% спиртом 5 минут. Сполоснуть дистиллированной водой и высушить на воздухе.

3. Поставить аппарат для окраски мазков в водяную баню при 37°С.

4. Смешать 37,7 мл 0,1 М раствора лимонной кислоты и с 12,3 мл 0,2 М Na^HPO^. определить рН и довести его до 3,3 при необходимости добавляя лимонную кислоту или раствор Na^PC), Залить смесь в аппарат для окраски мазков.

5. Когда температура раствора достигнет 37°С, погрузить в него фиксированные мазки. Непререрывно помешивая, инукбировать в нем мазки в течение 5 минут.

6. Через 5 минут вынуть мазки, сполоснуть водопроводной водой и высушить.

7. Окрасить раствором гематоксилина Гарриса 2 минуты и вновь сполоснуть водопроводной водой. Докрасить раствором эозина 2 минуты. Сполоснуть водопроводной водой и высушить.

8. Исследовать под микроскопом - вначале на малом увеличении, затем под иммерсионным объективом.

Результаты. Нормальные эритроциты видны как бледные серо-розовые «тени» на заднем плане, тогда как F-клетки выделяются как темные структуры (рис. 15).

Рис. 15. Хорошо видны темные F-клетки (эритроциты с HbF) и «тени» эритроцитов (светлые клетки) с нормальным НЬ. Окуляр 7, объектив 90 (собственные оригинальный препарат и фото).

68

Фетальные клетки в крови могут обнаруживаться и при так называемом наследственном персистировании HbF (163). При этой патологии HbF, как правило, распределяется в F клетках неравномерно (117).

ПРОБА НА РАСТВОРИМОСТЬ

Ряд других качественных гемоглобинов могут иметь при электрофорезе ту же подвижность, что и HbS. Для их различения может помочь проба на растворимость. HbS при ряде условий имеет значительно менее выраженную расворимость, по сравнению с другими гемоглобинами.

Ниже излагается методика одной из проб на растворимость гемоглобинов.

Растворы. 1. Фосфатный буфер 2,87 М с рН 6,5. Получают растворением 289,2 г К₂НР0₄ и 164,7 г КН₂Ю_Л в 1 литре дистиллированной воды.

2. Фосфатный буфер 2,49 М. Получают смешением 86,7 мл 2,87 М буфера и 100 мл дистиллированной воды.

3. Фосфатный буфер 1,10 М. Смешивают 3,83 мл 2,87 М буфера и 100 мл дистиллированной воды

4. NaHSO₃.

Методика. В отдельные пробирки налить по 4,5 мл каждого из фосфатных буферов, добавить 50 мг NaHS0₃, 0,5 мл 5% гемолизата исследуемой крови и оставить смесь на ночь при комнатной температуре. Утром профильтровать и исследовать на фотоэлектрокалориметре или стекгрофотометре с фильтром 540 наномикрон.

Растворимость различных гемоглобинов представлена ниже. Типы гемоглобинов Молярность буфера и процент растворимости 2,49 М                    2,87 М

АА                               90-95                       13-20

AD                          90-95                       13-20

AS                           25-35                       5-20

SS                             3-10                         2-4

Можно видеть, что растворимость HbS значительно ниже, чем других нормальных и патологических вариантов.

В случаях, трудных для дифференциальной диагностики, особенно при сочетании с талассемиеи, окончательный диагноз устанавливается при помощи изучения синтеза глобиновых цепей. Учитывая, все же, что эта методика относится к диагностике талассемий, считаем возможным, здесь ее не приводить.

69

НЕКОТОРЫЕ ДРУГИЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ДАННЫЕ ПРИ СКВ

В различных других анализах у больных СКА можно выявить ряд нарушений, однако, все они малоспецифичны для диагностики. Функциональные пробы печени выявляют минимальные нарушения. Содержание билирубина, особенно его конъюгированной фракции, повышается; экскреция уробилиногена увеличивается.

Активность АЛТ, ACT при СКА находится в пределах физиологической нормы. ЩФ также находят в пределах нормы; повышение ее отмечается при костных инфарктах и печеночных кризах.

Электрофорез белков показывает некоторое увеличение фракции гамма-глобулинов.

Изучение содержания растворенных в крови газов выявляет более низкие, чем у здоровых людей, значения напряжения 0₃ - 74,3±2,4 мм рт. ст. у больных с бессимптомным течением СКА, отсутствием отклонений в деятельности сердечно-сосудистой и дыхательной систем. Напряжение С0₂, так же как и рН крови, находится в физиологических пределах.

Может изменяться липидный состав плазмы крови: снижение общего содержания холестерина, холестерина, входящего в липопротеины с высокой и низкой плотностью, фосфолипидов и триглицеридов.

Исследование факторов свертывающей системы крови показали неоднозначные результаты. Установлено, что при СКА имеют место повышение фактора VIII, высокое число тромбоцитов, снижение фактора V и накопление продуктов распада фибриногена. Все это свидетельствует о том, что во время кризов имеет место ДВС синдром.

При бескризовом течении заболевания почти все показатели свертывающей системы крови не претерпевают существенных изменений.

Во время вазоокклюзионных кризов может иметь место тромбоцито-пения потребления и укорочение среднего времени их жизни. Увеличивается уровень фибриногена. Впрочем, никакой закономерности в изменениии тромбоцитов или фибриногена при СКА уловить не удается.

Интерес представляют данные по содержания ряда микроэлементов при СКА. При изучении обмена микроэлементов у больных СКА обнаружено снижение концентрации цинка в плазме, эритроцитах и волосах, сопровождающееся повышением его экскреции с мочой. Выявленное при этом заболевании уменьшение содержания магния в плазме и увеличение в эритроцитах дает основание полагать о перераспределении баланса магния в сторону его внутриэритроцитарного на-копления. По-видимому, при СКА

70

имеет место возрастание потребности эритроцитов в катионах магния; активация транспорта этих ионов из плазмы в эритроциты является вторичным процессом. Крометого, для СКА характерно увеличение концентрации меди в плазме, возникающее, по-видимому, вторично, вследствие дефицита цинка. Такая интерпретация фактов представляется рациональной, принимая во внимание существующие конкурентные взаимоотношения катионов цинка и меди.

Bouden et al. (55) показали, что ЯМРТ может значительно облегчить диагностику вазоокклюзионных кризов при болевых атаках в области костей.

ГЛАВА 4. ЛЕЧЕНИЕ И ПРОФИЛАКТИКА СКВ