Получение накопительной культуры

Накопление представляет собой основной этап процесса выделения, который позволяет выделить чистые культуры. Методы накопления имеют целью добиться увеличения относительного количества данного микроорганизма за счет создания благоприятных условий для его роста и выживания по сравнению с другими или путем пространственного отделения его от других членов популяции.

К физическим методам, которые могут быть использованы при получении накопительной культуры, следует отнести регуляцию роста температурой, тепловую и ультразвуковую обработку, ультрафиолетовое облучение и др. Можно использовать также и особенности некоторых других физических свойств данного микроорганизма, например, его размеры, подвижность, что позволяет отделять данный микроорганизм от других членов популяции. В качестве примеров можно привести следующие.

Получение накопительной культуры бактерий, обладающих скользящим типом движения. Пробы предварительно разведенного исследуемого биологического материала засевают петлей на скошенную агаризованную питательную среду в пробирках. Посевы инкубируют при оптимальной температуре. Клетки, характеризующиеся скользящим типом движения, поднимаются по поверхности среды и разрастаются далеко за зону нанесения посевного материала.

Использование освещения для получения культур цианобактерий. Для получения накопительных культур, образцы инкубируют при 25 °С и постоянном освещении от 500 до 3000 лк.

Инкубация при низкой температуре для получения культур психрофильных бактерий. Поскольку низкая температура способствует задержке роста многих бактерий, на первом этапе проводят инкубирование при температурах 0 – 5 °С. Чашки с образцами инкубируют при температуре ниже 5 °С в течение 14 – 24 дней.

При использовании химических методов применяют токсические вещества, которые убивают или подавляют рост оставшейся части популяции, не влияя на выделяемый микроорганизм. Примеры:

Условия инкубирования в кислой среде для выделения культур лактобацилл.

Высев производится на среду, которая за счет ацетатной буферной системы имеет рН 5,3. В этом случае Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum способны образовывать колонии, а другие молочнокислые бактерии – нет.

Ингибирование роста пенициллином для получения культур микоплазм. Поскольку микоплазмы лишены клеточной стенки, они устойчивы к высоким концентрациям пенициллина, который подавляет рост многих бактерий, имеющих клеточную стенку.

Бактериальные клетки как субстрат для миксобактерий. Некоторые виды миксобактерий способны с помощью литических ферментов лизировать клетки других бактерий и использовать высвобождающиеся при этом вещества для своего роста.

Биологические методы включают использование специфических хозяев выделяемого микроорганизма, а также преимуществ некоторых свойств патогенных микроорганизмов.

Получение накопительной культуры патогенных для животных организмов. Патогенные для животных бактерии можно выделить, заражая восприимчивое животное-хозяин смешанной культурой исследуемого материала, в котором предполагается его присутствие.

Например, чистую культуру пневмококков можно получить через
4 – 6 часов после внутрибрюшинного введения мыши 1 мл эмульгированной мокроты, содержащей S.pneumoniaе и другие бактерии.

Симбиоз растений с бактериями рода Rhizobium. Клубеньки, образуемые на корнях бобовых растений представляют собой природную накопительную культуру симбиотических азотфиксирующих бактерий.

Во многих случаях для получения накопительной культуры определенных бактерий используют сочетание физических, химических и биологических методов.

Выделение чистой культуры

Для выделения бактерий в виде чистых культур известно сравнительно мало методов. Чаще всего это делают путем изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде, используя метод посева штрихом или разлива по чашкам небольшого количества жидкой культуры (метод предельных разведений). Однако получение отдельной колонии не всегда гарантирует чистоту культуры, поскольку колонии могут вырасти не только из отдельных клеток, но и из их скоплений.

Получение изолированных колоний на твердой питательной среде достигается либо путем рассева взвеси микроорганизмов шпателем (метод Коха), либо с помощью бактериологической петли (метод истощающего штриха). В результате механического разобщения клеток микроорганизмов каждая из них может дать начало изолированной колонии одного вида микробов. Кроме того, существует метод Последовательного разведения в твердой среде. Это самый простой способ посева по чашкамПетри, а также метод упорядоченного посева (На лабораторных занятиях).

Рассев шпателем (метод Коха) производят в следующей последовательности:

а) на поверхность питательной среды в чашке № 1 наносят стерильной пипеткой каплю накопительной культуры и распределяют ее стерильным шпателем;

б) шпатель достают, чашку быстро закрывают и переносят шпатель в чашку № 2, не стерилизуя его. Имитируют распределение культуры по всей поверхности среды, прикасаясь к ее поверхности той же стороной шпателя, которой ранее распределяли пробу;

в) точно те же действия проводят и в чашке № 3, после чего шпатель стерилизуют;

г) засеянные чашки помещают в термостат и инкубируют при оптимальной температуре.

Через определенное время чашки достают из термостата и изучают рост микроорганизмов. Обычно в чашке № 1 наблюдается сплошной рост бактерий, в последующих чашках формируются изолированные колонии.

Рассев петлей (метод истощающего штриха) предполагает высев бактериологической петлей из накопительной культуры на поверхность агаризованной среды в чашках Петри. На первом этапе петлей с культурой наносят ряд параллельных штрихов на агаризованной среде (рис. 1, А). Петлю стерилизуют, остужают о незасеянную часть агаризованной среды и проводят серию штрихов в направлении, перпендикулярном первым (рис. 1, Б). Затем петлю вновь стерилизуют, остужают и штрихи наносят в направлении В (рис. 1), а после очередной стерилизации – в направлении Г (рис. 1).

Чашки помещают в термостат и через определенное время учитывают результаты. Обычно на штрихах А и Б вырастает большое число колоний (иногда сплошной рост), тогда как на штрихах В и Г формируются изолированные колонии.