ТЕМА 3. бактериологический метод: изучение биохимических свойств бактерий

Идентификация микробов представляет собой определение систематического положения выделенной из какого – либо источника культуры до уровня вида, для чего используют комплекс признаков: морфологических, химических, культуральных, биохимических, серологических, экологических. Для установления вида, рода и особенно варианта бактерий применяют определение биохимических признаков, так как каждый вид характеризуется определенным набором ферментов. Для дифференциации бактерий выявляют у них протеолитические, сахаролитические, антиоксидантные, гемолитические ферменты, а также способность бактерий к редукции некоторых веществ (красители, нитраты и др.).

Протеолитическая активность бактерий определяется их способностью разжижать желатину, свернутую сыворотку крови, образовывать при расщеплении белков индол, сероводород, аммиак.

Сахаролитические свойства бактерий выявляются в способности ферментировать углеводы с образованием различных кислых продуктов и газообразных веществ. Для этого используют короткий и длинный «пёстрый» ряд. Первый включает в себя среды Гиса с моно – дисахаридами (глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой) и с шестиатомным спиртом – маннитом. В длинный «пёстрый» ряд вводят дополнительно среды с моносахаридами, полисахаридами и спиртами. В качестве индикатора во все среды добавляют реактив Андраде (щелочной раствор кислого фуксина).

Чистую культуру исследуемых бактерий засевают на среды «пёстрого» ряда. Если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды; при разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляются пузырьки газа. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется.

Антиоксидантная активность бактерий заключается в способности разлагать активные формы кислорода, секретируемые активированными макрофагами. Основную роль играют: фермент каталаза – разлагающая перекись водорода и супероксиддисмутаза – разрушающая супероксиданион радикал.

Гемолитическая активность бактерий проявляется в способности расщеплять гемоглобин. В зависимости от полноты разложения гемоглобина выделяют три вида гемолитической активности - α,β,γ. Выявляют наличие этих ферментов при посеве на кровяной агар.

ЗАДАНИЕ

1. Просмотреть посевы на скошенном агаре, приготовить мазки, окрасить по Граму, микроскопировать.

2. Засеять чистую культуру в пробирку с мясо – пептонным бульоном для определения протеолитических свойств бактерий. Под пробку для выявления индола, сероводорода, аммиака. Обнаружение индола производится при помощи фильтровальной бумаги, пропитанной раствором щавелевой кислоты, высушенной и разрезанной на узкие полоски. В случае образования индола бумажка окрашивается в розовый цвет. При наличии сероводорода бумага, пропитанная раствором уксуснокислого свинца, чернеет. С целью выявления аммиака применяют лакмусовую бумажку, которая в положительном случае синеет.

3. Засеять исследуемую культуру на среды «пёстрого» ряда: с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом. Посев следует произвести уколом в столбик полужидкого агара, содержащего углевод и индикатор, затем инкубировать при 37⁰С в течение 18 – 24 часов.

4. Засеять исследуемую культуру в питательную среду Кларка для определения интенсивности ферментации глюкозы: реакция Фогес – Проскауэра и с метилрот. Среда Кларка содержит: 5 г пептона, 5 г глюкозы, 5 г калия фосфата двуосновного и до 1000 мл дистиллированного воды.

5. Определить наличие у бактерий каталазы, для чего на предметное стекло нанести каплю 3 % раствора Н₂О₂ и внести в неё петлю бактериальной культуры. Каталаза разлагает Н₂О₂ на воду и кислород. Выделение пузырьков кислорода свидетельствует о наличии у данного вида бактерий фермента каталазы.

Контрольные вопросы

1. Какими методами осуществляется идентификация бактерий?

2. Какие свойства бактерий характеризуют их биохимическую активность?

3. Как производится определение протеолитических свойств?

4. Каким путём определяют наличие у бактерий сахаролитических свойств?

5. Как выявляют у бактерий наличие фермента каталазы?

6. Каков принцип определения у бактерий редуцирующих свойств?