Техника получения крови, сыворотки и плазмы.

Получение крови. Небольшие количества крови у животных в основном берут из ушной раковины, для этого место взятия предварительно обрабатывают, выстригают или выбривают. Протирают тампоном смоченным спиртом 70%, после этого либо делают надрез сосуда, либо прокалывают вену иглой. Первую выступившую каплю снимают тампоном так как после обработки спиртом эритроциты в ней разрушаются. Затем по каплям кровь собирают в часовое стекло и сразу же набирают в пипетки для исследования. У человека берут кровь из среднего или безымянного пальца левой руки, предварительно протерев 70% спиртом. Большое количество крови у лошади, у КРС, у МРС берут кровь из ярёмной вены на границе верхней и средней трети шеи. Для этого на шее животного ниже места прокола накладывают жгут, чтобы вена наполнилась кровью, протирают её спиртом или настойкой йода, затем в вену под углом 45 градусов вводят стерильную острую иглу против тока крови по направлению к голове. Кровь собирают в пробирки или колбы. У свиней большие количества крови получают из хвоста. Для этого скальпелем отсекают около 1 см хвоста, собирают кровь в пробирки, затем кончик хвоста сдавливают резинкой или бинтом на 1-2 суток, рану тщательно дезинфицируют. У собаки большие количества крови получают из вены сафена (наружная поверхность бедра). У кроликов из ушной вены, у морских свинок из сердца, у кур из гребня или подкрановой вены.

Получение сыворотки крови. Для получения сыворотки крови она должна свернуться, для этого кровь собирают в чистые сухие пробирки, струю крови направляют по стенке пробирки, чтобы не образовалась пена, затем пробирки с кровью ставят в термостат на несколько часов для полного свёртывания, затем образовавшийся сгусток отделяют от стенок пробирки стеклянной палочкой: обводя вокруг сгустки, затем кровь отстаивают или центрифугируют, при этом сгусток уплотняется- ретракция и из него выделяется сыворотка соломенно-жёлтого цвета.

Получение плазмы крови. Кровь нужно предохранить от свёртывания, то есть стабилизировать. Для стабилизации крови используют антикоагулянты. К ним относится лимоннокислый Na, щавелевокислый Na, гепарин. В пробирку помещают антикоагулянт, затем берут кровь. После взятия пробирку несколько раз аккуратно переворачивают для перемешивания. При отстаивании или центрифугировании, кровь разделяют на 2 слоя: Сверху желтоватая мутная жидкость-плазма, внизу тёмно-вишнёвого цвета слой эритроцитов, а на нём небольшой белый налёт лейкоцитов.

Сыворотка крови отличается от плазмы тем, что в ней отсутствует белок фибриноген, так как из него образуется не растворённый фибрин, который стал основой для тромба.

Для того чтобы из плазмы получить сыворотку, нужно из неё осадить белок фибриноген. Затем от центрифугировать и отстаивать в отдельную пробирку сыворотку. ТХУ-трихлоруксусная кислота.

Определение объёма соотношения между плазмой и форменными элементами крови-это показатель гематокрита.

В крови содержится 55-60 % плазмы 40-45 форменных элементов. Для определения показателя гематокрита используют стабилизированную кровь (с добавлением антикоагулянта). Немного стабилизированной крови помещают на часовое стекло. Берут 2 капиллярные пробирки. Оба капилляра заполняют кровью. Затем оба конца капилляра затыкают пластилином, затем помещают в специальную центрифугу и центрифугируется при режиме 3-4 тысяч оборотов в минуту 8-10 минут. Извлекают капилляры. Кровь в них разделяется на 2 слоя. От центра плазма, от периферии форменные элементы. Затем капилляры помещают в специальную рамку. Определяют количества плазмы в обоих капиллярах и берут среднюю величину.

Форменные элементы крови.

1. Эритроциты. Красные кровяные тельца у высших животных округлые, безъядерные, диаметром 5-6 макромеров, сверху покрыты белково-серозной оболочкой, внутри строма-она представлена гемоглобином. Гемоглобин-пигмент, который по структуре является сложным белком, состоящим из простого белка глобина и красящего вещества гема, который является простетической частью. Гемоглобин состоит из 4 перойдных колец в центре которых двухвалентное железо. На разрезе эритроцит имеет двояковогнутый диск для увеличения площади поверхности.

2. Лейкоциты-белые кровяные тельца, крупнее эритроцитов, содержит ядро, способны к самостоятельному передвижению как в кровеносном русле, так и за его пределами. По строению и воспроизведению окраски их делят на 2 группы: зернистые (гранулоциты) и не зернистые (агранулоциты). К зернистым относят базофилы, эозинофилы, нейтрофилы. Нейтрофилы по степени зрелости делят на юные, палочкоядерные и сегментоядерные.

Агранулоциты-лимфоциты (малые, средние, большие). Моноциты. У всех животных и человека преобладают сегментоядерные нейтрофилы и лимфоциты с разными вариациями.

Гемоглобин-сложный белок, который находится внутри эритроцитов и составляет его строму. Гемоглобин за счёт двухвалентного железа в составе гема может присоединять кислород-оксигемоглобин, это не прочное соединение, оно образуется в сосудах лёгких, отдаёт кислород в тканевую жидкость и восстанавливается. Соединение гемоглобина с углекислым газом-карбгемоглобин, оно образуется в тканях, транспортируется в лёгких. Карбгемоглобин легко отдаёт углекислый газ и присоединяет кислород.

Cito! – Быстро. Тройчатка экспресс анализа крови-это уровень гемоглобина, количество лейкоцитов в крови и скорость оседание эритроцитов. Для того чтобы определить уровень гемоглобина нужно разрушить эритроциты и выделить гемоглобин в раствор.

Физиологические соединения гемоглобина — это оксигемоглобин, карбгемоглобин, восстановленный. Патологических видов гемоглобина более 50-ти. Из них карбоксигемоглобин соединение гемоглобина с угарным газом, очень прочное соединение, метгемоглобин соединение, в котором железо меняет свою валентность и становится трёхвалентным и это также приводит к образованию очень прочных соединений.

СОЭ (скорость оседания эритроцитов).

Если взять кровь, стабилизированную лимоннокислым натрием и набрать её в капилляр, поставить капилляр вертикально, эритроциты начнут оседать, сверху будет оставаться плазма. Скорость оседания эритроцитов может быть различной. Это зависит от нескольких факторов, от вида животного. Самая высокая скорость оседания эритроцитов у лошади и составляет 64 мм\ч. У КРС и МРС, кроликов 0.5-1 мм\ч, собака 2.5 мм\ч, у свиньи 34 мм\ч, у человека 4-8 мм\ч. Кроме того у каждого индивидуума в течении жизни СОЭ может меняться. В физиологических условиях, то есть в норме СОЭ меняется не значительно, однако у женской особи во 2-ой половине беременности СОЭ значительно увеличивается. Чаще всего СОЭ ускоряется или замедляется при патологиях.

Например, СОЭ замедляется при сгущении крови, ускоряется при наличии в организме воспалительных процессов при которых образуются много защитных белков глобулинов, они адсорбируются на эритроцитах, понижая их поверхностный заряд и в столбике крови эритроциты будут оседать быстрее. СОЭ важный диагностический показатель и входит в тройчатку экспресс анализа крови.

Гемолиз эритроцитов. Это разрушение оболочки эритроцитов и выход гемоглобина в раствор. Различают несколько видов гемолиза:

1. Осмотический.

2. Химический.

3. Температурный.

4. Механический.

Осмотический гемолиз основан на том, что в гипотонических растворах эритроциты разрушаются в зависимости от их концентрации, причём эритроциты разных индивидуумов по-разному разрушаются в гипотонических растворах-это значит, что эритроциты обладают осмотической резистентностью-это способность эритроцитов противостоять пониженному осмотическому давлению.

Химический основан на разрушении эритроцитов под действием химических веществ (аммиак, дистиллированная вода, кислоты).

Температурный основан на разрушении эритроцитов после размораживания, предварительно замороженных эритроцитов. Механический при перемешивании.

Свёртывание крови.

Свёртывание крови — это защитная реакция организма, которая предохраняет его от кровопотерь. Свёртывание крови запускается при нарушении целостности сосудистой стенки, при механических или других повреждениях, или при появлении на сосудистой стенке шероховатостей. В крови есть вещества 3 категорий, которые участвуют в свёртывании крови:

1. Вещества, способствующие свёртыванию. Они объединяются в свёртывающуюся систему крови.

2. Вещества, препятствующие свёртыванию крови. Они объединились в противсвёртывающую систему.

3. Система веществ, обуславливающих разжижение уже свернувшейся крови-это фибринолитическая система.

Свёртывание крови складывается из взаимодействия их компонентов:

1. Гемостаз-остановка кровотока.

2. Рефлекторное сужение повреждённых кровеносных сосудов вплоть до спазма.

3. Гуморальное сужение под действием гормонов и медиаторов адреналин, серотонин, норадреналин.

4. Агрегация (прилипание) тромбоцитов друг к другу и их повреждение.

 

 

Свёртывающая система крови.

Выделяют 13 факторов свёртывания:

I. Фибриноген-белок плазмы крови, который попадая в необычную среду превращается в нерастворимую фазу-фибрин.

II. Протромбин-неактивная форма фермента, который при определённых условиях превращается в активный тромбин.

III. Тромбопластин-фермент, выделяющийся из тромбоцитов и активирующий протромбин.

IV. Ионизированный кальций-участвует во всех фазах свёртывания, активирует все ферменты.

V. Акцелерин (Ас)- фермент, ускоряющий активацию тромбопластина.

VI.

VII. Проконвертин- сходен с 5 фактором, участвует в образовании тромбопластина.

VIII. Антигемофильный глобулин А. Участвуют в образовании

IX. Антигемофильный глобулин В. Тромбопластина.

X. Тромботропин плазмы – участвует в образовании тромба.

XI. Протромбопластин плазмы.

XII. Фактор Хагемана. Он активирует протромбопластин.

XIII. Фибринстабилизирующий фактор (ФСФ).

Свёртывание крови проходит в 3 фазы и представляет собой цепь ферментативных реакций. Результат каждой ферментативной реакции становится пусковым механизмом для следующей ферментативной реакции.

Цепи ферментативных реакций предшествует следующей реакции. Это рефлекторный спазм травмированного сосуда и образование «тромбоцитарного гвоздя». Его образование начинается с изменения заряда сосудистой стенки в месте повреждения. Возникает смена заряда. Это приводит к тому, что форменные элементы начинают скучиваться около повреждённого участка. Особая роль принадлежит тромбоцитам. Они скучиваются, слипаются между собой (агрегация), что приводит к первичному гемостазу. Агрегация тромбоцитов приводит к их нарушению. Из них выходят БАВ, которые запускают ферментативное свёртывание (коагуляционный гемостаз). В нём различают три фазы:

1. При разрушении тромбоцитов из них освобождается тромбопластин, который называется кровяной тромбопластин. Из повреждённой сосудистой стенки освобождается тканевой тромбопластин. В норме они в организме отсутствуют и выделяются только при повреждении стенки. При их участии образуется фермент-кровяная и тканевая протромбиназа. Это происходит под влиянием 5 8 9 10 и 11 факторов с участием ионов кальция.

2. Заключается в активации протромбина и превращению его в активный тромбин под влиянием 5 7 факторов и в присутствии ионов кальция.

3. Заключается в образовании фибрина. Идёт в 3 этапа:

a. Протеолитический этап. Тромбин действует на фибриноген, отщепляет от него отдельные мономеры, образуется профибрин.

b. Полимеризация. При участии кальция молекулы профибрина склеиваются. Образуется фибрин-полимер.

c. Под влиянием 8 фактора молекулы фибрин-полимера цементируются. Образуется окончательный фибрин. Он выпадает в виде нитей, в них запутываются форменные элементы, образуется сгусток.

Это не окончательный этап, так как через некоторое время начинается укорочение нитей фибрина, которое вызывает уплотнение сгустка и отжатие от него жидкости-сыворотки. Уплотнение сгустка ретракция-сложный биологический процесс, который приводит к плотному закрытию сосуда пробкой, края раны при этом сближаются. Фибриновая пробка со временем растворяется. Этот процесс-фибринолиз осуществляется под действием фибринолитической системы.