Приготовление питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей растений

Природные инструменты генетической инженерии растений: Инструментами генетической инженерии служат ферменты и векторы. С помощью набора ферментов метаболизма нуклеиновых кислот (рест-риктазы, репликазы, транскриптазы, лигазы) можно выделять из хромосом нужные участки ДНК, копировать их, сшивать фрагменты. Векторы представляют собой молекулы, целенаправленно проникающие в клетки других видов и встраивающие генетическую информацию в ядерный геном. В генетической инженерии растений применяют специальные векторы, полученные на основе плазмид бактерий и вирусов растений (например, вируса мозаики цветной капусты ВМЦК), разрабатывают векторы на основе митохондриальной и хлоропластной ДНК. Наиболее удобными оказались векторы на базе плазмиды возбудителя рака корней Agrobacteriumtumefacies, так называемые Ti-плазмиды. Ti-плазмида имеет уникальные биологические свойства, благодаря которым ее используют в качестве вектора: способность проникать в клетки широкого круга двудольных растений и встраивать часть информации (область Т-ДНК) в хромосомы. Любой фрагмент чужеродной ДНК, вставленный в область Т-ДНК, может быть перенесен в растительный геном. Для облегчения размножения копий генов (клонирования) и переноса генетической информации применяют комбинации векторов. Эти комбинации получили название коинтегративные и бинарные векторы.

Распространение и площпди выращивания ГМ культур в мире

Растения, полученные с помощью генетической инженерии, их ценные признаки и площади их посевов в мире.

Регуляция экспрессии генов как основа дифференцировки клеток, морфогенеза и адаптации

Роль каллусной ткани в интактном растений

Сорта растений, полученные методами индукции сомаклональной вариабельности

Сохранение биоразнообразия растений методом клонального микроразмножения Типы векторных систем

Сущность и задачи клеточных технологий растений.

Задачи: 1)Получение и применение культур клеок живт., раст., чел., и бактерий для культивирования вирусов с целью создания вакцин, сывороток, диагностических препаратов. 2) Культивирование культур клеток для поучения биологически активных веществ. 3) Получение моноклональных антител для использования в медицине и ветеринарии. 4) Генно-инженерные манипуляции с клетками для получения новых форм, новых культур клеток, биопрепаратов и др.

Сущность и значение партеногенеза, гиногенеза, андрогенеза Требования, предъявляемые к векторам генетической инженерии растений

Техника культивирования растительных эксплантов на разных этапах клонального микроразмножения Этапы клонального микроразмножения: отбор подходящих эксплантов, их стерилизация и перенос на питательную среду; собственно микроразмножение; укоренение побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям; выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к посадке в поле. Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды.
Первый этап. На этом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. Это осуществляется путем стерилизации растительных тканей ртутьсодержащими растворами (сулема, или диацид, 0,1—0,2%-ная) или хлорсодержащими (хлорамин 10—15%-ный, гипохлорит натрия или кальция 5—10%-ный) в течение 5—10 мин для нежных, легко повреждаемых тканей растений и 10—12 мин — для тканей, имеющих более плотную оболочку. После этого растительные ткани необходимо тщательно промыть в стерильной дистиллированной воде, как правило, в трех порциях и перенести на заранее приготовленную стерильную питательную среду. Если исходную стерильную культуру экспланта получить трудно, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бензилпенициллин и др.) в концентрации 100—200 мг/л. Это в первую очередь относится к древесным растениям, у которых наблюдается тенденция к накоплению внутренней инфекции.На первом этапе, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по рецепту Мурасига и Скуга, а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объекта. В случае, когда наблюдается ингибирование роста первичного экспланта за счет выделения им в питательную среду токсичных веществ (фенолов, терпенов и других вторичных соединений), усилить его рост можно, используя антиоксиданты. Это возможно двумя способами: омывкой экспланта слабым раствором антиоксиданта в течение 4—24 ч; непосредственным добавлением антиоксиданта в питательную среду. В качестве антиоксидантов используют: аскорбиновую кислоту (1—60 мг/л), глютатион (4—5 мг/л), дитиотриэтол (1—3 мг/л), диэтилдитиокарбамат (2—5 мг/л), поливинилпирролидон (5000—10 000 мг/л). В некоторых случаях целесообразно добавлять в питательную среду адсорбент — древесный активированный уголь в концентрации 0,5—1 %. Продолжительность первого этапа — от 1 до 2 месяцев, в результате которого наблюдается рост меристематических тканей и формирование первичных побегов.
Второй этап — собственно микроразмножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов, учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличивается число растений-регенерантов с ненормальной морфологией и возможно образование растений-мутантов. Как и на первом этапе, используют питательную среду по рецепту Мурасига и Скуга, содержащую различные биологически активные вещества, а также регуляторы роста. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов — ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л. При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (5—10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией. Вместе с тем возможно наблюдать такие нежелательные для клонального микроразмножения эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных (оводненных) побегов и уменьшение способности растений к укоренению. Отрицательное действие цитокининов возможно преодолеть, по данным Н. В. Катавой и Р. Г. Бутенко, используя питательные среды с минимальной концентрацией цитокининов, обеспечивающих стабильный коэффициент микроразмножения, или чередованием циклов культивирования на средах с низким и высоким уровнем фитогормонов.
3—4 этапы — укоренение микропобегов, их последующая адаптация к почвенным условиям и высадка в поле являются наиболее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального микроразмножения. На третьем этапе, как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга или заменяют ее средой Уайта, уменьшают количество сахара до 0,5—1 % и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования используют бета-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), ИУК или НУК. Укоренение микропобегов проводят двумя способами: 1) выдерживание микропобегов в течение нескольких часов (2—24 ч) в стерильном концентрированном растворе ауксина (20—50 мг/л) и последующее их культивирование на агаризованной среде без гормонов или непосредственно в подходящем почвенном субстрате (импульсная обработка); 2) непосредственное культивирование микропобегов в течение 3—4 недель на питательной среде, содержащей ауксин в невысоких концентрациях (1—5 мг/л в зависимости от исследуемого объекта). В последнее время предложен пока мало практикуемый метод укоренения пробирочных растений — в условиях гидропоники. Этот метод позволяет значительно упростить этап укоренения и одновременно получать растения, адаптированные к естественным условиям. Для картофеля возможно использовать безсубстратную гидропонику для получения миниклубней. Затенение нижней части культуральных сосудов плотной черной материей или добавление в питательную среду активированного угля способствует укоренению микропобегов.
Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс клонального микроразмножения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений — весна или начало лета. Растения с двумя-тремя листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85—90 °C в течение 1—2 ч. Для большинства растений в качестве субстратов используют торф, песок (3:1); торф, дерновую почву, перлит (1:1:1); торф, песок, перлит (1:1:1). Исключение составляют семейство орхидных, для которых готовят субстрат, состоящий из сфагнового мха, смеси торфа, листьев бука или дуба, сосновой коры (1:1:1). Приготовленным заранее почвенным субстратом заполняют пикировочные ящики или торфяные горшочки, в которых выращивают растения-регенеранты. Горшочки с растениями помещают в теплицы с регулируемым температурным режимом (20—22 °C), освещенностью не более 5 тыс. лк и влажностью 65—90 %. Для лучшего роста растений создают условия искусственного тумана. В тех случаях, когда нет возможности создать такие условия, горшочки с растениями накрывают стеклянными банками или полиэтиленовыми пакетами, которые постепенно открывают до полной адаптации растений.
Через 20—30 дней после посадки хорошо укоренившиеся растения подкармливают растворами минеральных солей Кнудсона, Мурасига и Скуга, Чеснокова, Кнопа (в зависимости от вида растений) или комплексным минеральным удобрением. По мере роста растений их рассаживают в большие емкости со свежим субстратом. Дальнейшее выращивание акклиматизированных растений соответствует принятой агротехнике выращивания для каждого индивидуального вида растений.
Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений. Это связано, в первую очередь, с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность устичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, что приводит, в свою очередь, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы. Поэтому целесообразно на третьем или четвертом этапах клонального микроразмножения применять искусственную микоризацию растений (для микотрофных), учитывая их положительную роль в снабжении растений минеральными и органическими питательными веществами, водой, биологически активными веществами, а также в защите растений от патогенов. Существует два способа заражения растений микоризообразующими грибами: 1) in vitro (в стерильных условиях); 2) in vivo (в естественных условиях). Первый способ более благоприятен, так как в этом случае исключается возможность загрязнений почвы другими микроорганизмами. Кроме того, в условиях in vitro есть возможность контролировать условия культивирования (свет, температура, влажность) и подбирать субстрат (рН, аэрация), обеспечивающий нормальное формирование микоризы. Растения, размноженные in vitro, развиваются значительно лучше, если их корневая система находилась в контакте с микоризообразующими грибами. В этом случае улучшалось снабжение их азотом, увеличилась в 1,5—2 раза приживаемость растений при их пересадке в почву, а также повышался прирост надземной биомассы. Такие работы были проведены с березой, эвкалиптом, каштаном, сосной, лохом и разными клонами ольхи.

Тотипотентность. Редифференциация: Тотипотентность – это свойство соматических клеток растений полностью реализовывать свой потенциал развития с образованием целого организма. Сущность его состоит в том, что если растительная клетка изолируется, она ведет себя подобно клетке зародышевого мешка, то есть образует эмбриоид и целое растение.Тотипотентность культивируемых клеток свидетельствует том, что генетическая информация сохраняется. Но для ее реализации требуются специфические условия. К числу факторов, способных полностью или хотя бы частично восстановить замаскированную генетическую информацию, относятся свет, регуляторы роста, предшественники и элементы питания. Стимулирующее действие света на образование вторичных соединений было показано на примере каротиноидов, эфирных масел. Кроме этого важны температура, влажность, освещенность и периодическое обновление питательной среды, так как по мере роста клеток в ней накапливаются продукты метаболизма, что неблагоприятно действует на культуру. поэтому данная методика связана с пересадками, т.е. с переносом части биомассы на новую среду в другом сосуде («пассажи»). При культивировании растительные клетки имеют более низкие темпы размножения, чем микробиологические объекты, поэтому продолжительность культивирования определяется не десятками часов, а десятками суток.

РЕДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ – переход специализированных клеток из одного состояния дифференцировки в другое с предшествующими делениями или непосредственно.

Типы векторов для трансформации. Строение Ti- плазмиды агробактерий. Вектора на основе Ti-плазмид. Плазмидные векторы. В качестве векторов используются плазмиды бактерий, и для трансформации растений чаще всего Ti-плазмида почвенной бактерии Agrobakterium tumefaciens. В природе A. tumefaciens проникают в клетки корней растений и там размножаются. При этом часть плазмидной ДНК (Т-ДНК) встраивается в хромосомы поврежденных (зараженных) клеток, индуцируя образование галлов (опухолей).При трансформации используют разоруженную Ti-плазмиду, без онкогенов, вызывающих образование галлов. Вместо них встраивают нужные исследователю гены и плюс репортерные гены, подтверждающие о встраивании Т-ДНК в геном растения. Это гены неомицинфосфотрансферазы II (NRTII), дигидрофолатредуктазы,гигромицинфосфотрансферазы(НРТ), в результате экспрессии которых трансформированная клетка становится устойчивой к антибиотикам канамицину, мететрексиату и гигромицину В. При культивировании трансформированных клеток на среде с данным антибиотиком выживают только клетки, у которых Т-ДНК включена в геном. Помимо встроенных генов Ti-плазмида должна содержать гены vir-областей (vir А, vir В, vir С, vir D, vir G), обеспечивающих сам процесс встраивания Т-ДНК в хромосому. Была создана бинарная система трансформации, состоящая из небольшой, реплицирующейся как в E.coli, так и в A. tumefaciens, плазмиды (5-10 тыс. п.н.), несущей переносимые гены, и Ti-плазмиды, несущей vir-гены с делетированной Т-ДНК. С использованием A. tumefaciens легче трансформировать двудольные растения (горох, табак и т.п.), чем однодольные (пшеница, кукуруза). Но это зависит от метода трансформации. К настоящему времени создано огромное число плазмид, которые используются в качестве векторов при трансформации, как растений, так и животных. Вирусные векторы. При трансформации растений используют и векторы, сконструированные на основе растительных вирусов. Но их набор ограничен, так как у большинства растительных вирусов генетическим материалом является РНК, и только у некоторых из них, таких, как вирус мозаики цветной капусты (CaMV) и группы вирусов Gemini, наследственным материалом служит ДНК. Недостаток вирусных векторов – ограниченная протяженность встраиваемых генов (от 200 до 500 п.н.) и высокая специфичность по отношению к видам растений. Так, вирус мозаики цветной капусты можно использовать только при трансформации растений, относящихся к семейству крестоцветных. Векторные системы на основе Ti- плазмид -Tiплазмида грамотрицательных почвенных бактерий Agrobacterium tumefaciens, вызывает заболевание «корончатый галл» -Размер 200-250 тпн, содержит Т-область (transferredDNA) 10-30 тпн, 35 генов вирулентности (vir), способна передаваться в растительную клетку; -Перенос плазмиды происходит через пили бактерий, а затем через канал в клеточной мембране растения; -ДНК проникает в ядро растительной клетки и встраивается в геном, сайты инсерции случайны, однако имеется преимущественное внедрение в транскрипционно активные области генома; -Т-ДНК кодирует ферменты синтеза фитогормонов, индуцирующих разрастание трансформированных клеток, а также ферменты синтеза аминокислот и сахаров; -Гены ферментов биосинтеза гормонов и необычных аминокислот эволюционно адаптированы для экспрессии только в растительных клетках, поэтому агробактерии являются «природными генными инженерами Все векторы на основе Ti-плазмид содержат следующие элементы: ♦ селективный маркерный ген, который обеспечивает устойчивость трансформированных клеток к антибиотикам; ♦ сайт инициации репликации, который позволяет плазмиде реплицироваться в Е. coli. Некоторые векторы содержат также и сайт инициации репликации A. tumefaciens; ♦ правая фланкирующая последовательность Т-ДНК, которая абсолютно необходима для интеграции Т-ДНК в клеточную ДНК растений; ♦ полилинкер (множественный сайт клонирования) для встраивания гена в участок между границами Т-ДНК