Что такое соматическая гибридизация?

Под соматической гибридизацией понимается гибридизация между протопластами, выделенными из соматических клеток растений. Обычно для соматической гибридизации используют протопласты, полученные из мезофильных клеток листа или каллусных тканей. Термин "соматическая гибридизация" впервые предложен Г.Мельхерсом (1974). Для обозначения соматического гибрида используют вместо формулы Ах В, принятой для записи половой гибридизации, формулы А+В или А (х) В. Для обозначения гибрида, несущего гены ядра только одного из родителей, наряду с цитоплазматическими (внеядерными) генами от обоих или только от другого родителя, используют термин " цитоплазматический гибрид" ("цибрид"). Гибриды, несущие альтернативные цитоплазматические гены от обоих родителей, называют "цитоплазматическими гетерозиготами" ("цитогетами").

Первое слияние протопластов было получено Пауэром и др. в 1970 году. Соматическая гибридизация растений включает четыре отдельных этапа:

а) выделение протопластов

б) слияние протопластов

в) отбор и регенерация растений

г) анализ растений – регенерантов

Ю.Ю. Глеба, К.Н.Сытник (1982,1984) отмечают, что соматическая гибридизация открывает перед исследователем возможность:

1) скрещивать филогенетически отдаленные виды растений (организмов), которые невозможно скрестить половым путем;

2) получить асимметричные гибриды, несущие весь генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами (или несколькими генами, или только органеллами и цитоплазмой) другого;

3) создать систему гибридизации, включающую одновременное слияние трех и более родительских клеток;

4) получить растения, гетезиготные по внеядерным генам(генам пластид и митохондрий)

Принципиальные различия между половыми и соматическими гибридами заключаются в следующем. При половой гибридизации происходит слияние ядер материнского и отцовского организмов и цитоплазмы материнского организма. При соматической гибридизации возможно слияние как ядер, так и цитоплазм материнского и отцовского организмов. При этом имеет место совершенно иной тип наследования ядерных и цитоплазматических генов. Ядерные гены при соматической гибридизации наследуются как дву-, так однородительски, тогда как при половой- только двуродительски. Внеядерные гены при соматической гибридизации наследуются двуродительски, а при половой передаются обычно только по материнской линии.

В результате слияния протопластов можно получить после регенерации растения, создание которых невозможно половым путем:

1)растения, ядро которых происходит от одного родителя, а цитоплазма от другого (цибриды);

2) растения, гетерозиготные по внеядерным генам (цитогеты):

3) растения, часть внеядерных генов которых происходит от одного родителя, а часть от другого.

Слияние протопластов. Методы выделения протопластов описаны нами ранее. Для слияния протопластов используют два основных подхода:

1. Использование полиэтиленгликоля (ПЭГ) в сочетании с высоким рН (9-11) среды и повышенным содержанием ионов кальция Са2+(100-300мМ). Полиэтиленгликоль выполняет роль индуктора слияния, который обеспечивает агглютинацию (слипание). Высокое значение рН и высокая концентрация ионов кальция необходимы для нейтрализации отрицательного поверхностного заряда, который имеют протопласты. В местах слипания происходит разрыв плазмалемм протопластов, приводящий к их слиянию. На этот процесс оказывают влияние, помимо внешних факторов, особенности тканевой принадлежности клеток. Легко сливаются меристемные и каллусные протопласты, менее эффективно сливаются сильно вакуолизированные клетки и клетки с развитыми хлоропластами (например, мезофильные протопласты)

2. Электрослияние протопластов. В этом случае протопласты помещают в неоднородное переменное электрическое поле. В этих условиях протопласты образуют мостик из нескольких клеток между электродами. После пропускания единичных импульсов тока происходит слияние протопластов в результате разрыва их плазмалемм. Эффективность метода слияния протопластов определяют по частоте слившихся протопластов, частоте клеточных клонов, образовавшихся из гибридных клеток, а также частоте образования гибридных проростков. В результате слияния протопластов образуются гомокарионы- продукты слияния генетически идентичных клеток, и гетерокарионы –продукты слияния генетически неидентичных клеток. Какова судьба слившихся протопластов? Возможны следующие варианты (Першина, 2000):

- синхронное деление двух ядер без их слияния и образование в результате исходных делений двуядерных дочерних клеток;

- слияние ядер во время митотического деления и формирование в дальнейшем одноядерных гибридных дочерних клеток.

Стабильность ядерных и цитоплазматических носителей генетической информации зависит от степени филогенетического родства родителей. При филогенетической отдаленности в процессе последующего деления клеток может происходить элиминация хромосом одного из родителей с последующим однородительским наследованием генов. Степень элиминации может быть различной. При этом соматические гибриды, сохраняющие оба ядерных генома, называются симметрическими, а соматические гибриды, несущие хромосомы преимущественно одного родителя – асимметрическими. Элиминацию хромосом одного из видов можно индуцировать путем обработки протопластов этого вида радиацией или химическими агентами. Таким образом, при соматической гибридизации возникает источник генетической изменчивости в результате реконструкции ядерных геномов и переноса генов от одного родителя другому.

Так, в результате слияния протопластов культурного вида картофеля Solanum tuberosum и дикорастущего вида томата Lycopersiсon pimpinellifolium получены растения с реконструированным ядерным геномом картофеля и интрогрессией генов томата, контролирующих устойчивость к болезням.

Вторым источником генетической изменчивости при соматической гибридизации является сегрегация (разделение между дочерними клетками) митохондрий и пластид, полученных от обоих родителей. Такая сегрегация происходит независимо от событий, происходящих в ядре, причем митохондрии сегрегируют независимо от пластид. Такое неменделевское расщепление по генам цитоплазмы обеспечивает варианты как однородительского, так и двуродительского их наследования и различные варианты сочетания органелл в цитоплазме дочерних клеток (Рис.6.5). Дополнительным источником изменчивости по цитоплазматическим генам является процесс рекомбинации генов митохондрий или пластид. Учитывая, что цитоплазматические гены во многом определяют продуктивность и устойчивость культурных растений (Давыденко, 2001), использование изменчивости по этим генам, создаваемой при соматической гибридизации – важный ресурс в селекции растений.

В целом следует отметить, что расширение возможного спектра изменчивости как по ядерным, так и по цитоплазматическим генам при соматической гибридизации в сравнении с половой, а также возможность вовлечения в гибридизацию филогенетически отдаленных видов создает перспективы для создания принципиально новых генотипов растений, несущих различные комбинации ядерных и цитоплазматических генов родителей.

Отбор и регенерация гибридных растений. Важной задачей является идентификация и отбор гетерокарионов в смешанной популяции протопластов после их слияния. Отбор гибридов может производиться как на клеточном, так и на организменном уровне. Наиболее употребимы следующие методы отбора продуктов слияния протопластов:

Механическая изоляция – применение морфологически контрастных типов родительских протопластов, после слияния которых гетерокарионы обнаруживают визуально под микроскопом, изолируют микропипеткой и переносят на среду для культивирования. Примером могут служить такие визуальные маркеры, как зеленые протопласты мезофила листа, которые комбинируют с бесхлорофилльными протопластов из клеток каллуса. Гибридные протопласты в этом случае отличаются от родительских по содержанию хлорофилла.

Метод генетической комплектации предполагает использование в качестве родителей двух мутантов, несущих неаллельные рецессивные летальные гены, вызывающие гибель организма при определенных условиях культивирования. Примером могут служить хлорофиллдефектные мутанты, каждый из которых гомозиготен по одному гену, вызывающему гибель растения на свету. При соматической гибридизации двух мутантов происходит генетическая комлементация, в результате которой гибриды, гетерозисные по двум аллелям хлорофиллдефектности, приобретают способность к образованию хлорофилла.

Метод физиологической комплементации подразумевает способность гибридных клеток размножаться и переходить к морфогенезу в условиях культуры, при которых родительские клетки этого делать не в состоянии, причем это является нормальной физиологической реакцией клетки на внешние условия. Так, Э. Кокинг (1974,1977) предложил метод, основанный на изучении альтернативных условий культуры, пригодных для роста клеток одного из партнеров для слияния, но не пригодных для роста другого. В этом случае суспензию клеток после слияния помещают последовательно на среду, на которой не способен расти первый родитель, а затем переносят на среду, где гибнут клетки второго родителя и остаются только гибридные клетки.

Метод инактивации протопластов основан на использовании Х или - лучей или биохимических ядов для инактивации протопластов одного или двух родителей. Так, Ф. Зельцер (1978) предложен метод получения цибридов путем направленной элиминации генома одного из родителей после предварительного облучения протопластов одного из партнеров х или - лучами.

В.А.Сидоров (1990) получил цибриды картофеля S.tuвerosum, содержащие пластиды диких видов картофеля путем инактивации ядра протопластов этих видов кобальтовой пушкой. Такой подход свидетельствует о возможности переноса цитоплазматических генов культурным растениям от их близкородственных видов. Получение соматических гибридов представляет интерес как для изучения методов преодоления нескрещиваемости при отдаленной гибридизации, так и для получения гибридов, представляющих хозяйственный интерес для селекционеров. Однако преодоление несовместимости генетических систем отдаленных видов - весьма трудная задача, сложность решения которой растет по мере возрастания филогенетической отдаленности видов (Першина, 2000).

При межцарственной соматической гибридизации растительных и животных клеток (клетки человека + бобовые, клетки человека + морковь, клетки человека + табак, клетки крысы + дрожжей) гибридные клетки не делятся.

В результате межсемейственной соматической гибридизации (соя + табак, табак +бобы) гетерокарионы при делении образуют клеточные линии, неспособные к регенерации растений.

При межтрибной соматической гибридизации (арабидопсис + турнепс, картофель + табак) получаются клеточные линии, способные к регенерации растений, имеющих аномалии в развитии. При этом могут образовываться как симметрические, так и асимметрические гибриды.

Межродовые соматические гибриды могут быть как симметрическими (Сitrus sinensis + Poncirus trifoliata), так и асимметрическими (картофель + томат).

Таким образом, гибридизация соматических клеток позволяет преодолеть созданные эволюцией барьеры несовместимости и скрещивать между собой растения, принадлежащие к различным видам, родам, семействам и трибам. При этом обычно наблюдается элиминация хромосом одного из родителей. Чаще всего гибриды между отдаленными видами аномальные и не дают потомства. Однако большой практический интерес представляет создание асимметрических гибридов, несущих полный геном одного из родителей и лишь несколько хромосом или генов другого.

Получены фертильные межвидовые амфиплоиды дурмана с повышенным на 20-25 % выходом алкалоидов. Созданы фертильные амфиплоиды межвидовых гибридов табака, картофеля, баклажанов. Путем слияния протопластов удалось ресинтезировать рапс, являющейся естественным амфидиплоидом между турнепсом и капустой. Полученные гибриды фертильны и могут быть вовлечены в селекцию. Слиянием протопластов кочанной капусты и редьки осуществлен перенос цитоплазматической мужской стерильности в капусту. Большой селекционный интерес представляют также цибриды, полученные у картофеля, томатов, капусты.