Основные методы выделения микробов -продуцентов антибиотиков

Высев почвенной взвеси в воде на поверхность агаровой пластинки. Определенную навеску почвы, тщательно растертую в ступке с небольшим объемом воды, количественно переносят в колбу со стерильной водой. Содержимое колбы встряхивают в течение 5 мин, а затем из водной суспензии делают ряд последовательных разведений, которые высевают на соответствующую агаризованную среду.

В дальнейшем для получения чистых культур отдельные колонии после инкубации в термостате при нужной температуре пересевают в пробирки со скошенным питательным агаром.

Каждую чистую культуру микроорганизма пересевают на различные по составу среды и после достаточно хорошего развития проверяют ее антибиотические свойства.

Высев почвы на питательный агар, предварительно засеянный тест-организмом. Поверхность питательного агара засевают тест-культурой необходимого организма, после чего на агаровую пластинку раскладывают небольшие (не более просяного зерна) комочки почвы или же почву наносят в виде пыли, распределяя ее по всей поверхности пластинки. Затем чашки помещают в термостат и через определенный промежуток времени (24-48 ч, а иногда и более) просматривают кусочки почвы или отдельные ее участки, вокруг которых образовались зоны задержки роста тест-организма. Из этих участков выделяют чистые культуры организмов и изучают их.

Метод можно модифицировать. На чашки Петри с мясопептонным агаром, предварительно засеянным тест-организмом, микробиологической петлей наносят отдельными каплями взвесь почвы. На каждую чашку наносят 10-20 капель, которые, подсыхая, оставляют после себя изолированные комочки почвы. Через 1-2 сут. нахождения чашек в термостате при 26-35 °С комочки почвы обрастают колониями и вокруг некоторых из них обнаруживаются зоны задержки роста тест-организма. Комочки, окруженные зонами, рассевают на свежие чашки с агаром, и после того как вырастут отдельные колонии, их отсевают для получения чистых культур, которые исследуют.

Метод обогащения почвы. Почву, из которой предполагают выделить антагонисты, обогащают организмами тех видов, по отношению к которым хотят получить антагонист. С этой целью к образцам почвы, помещенным в стеклянные сосуды, систематически добавляют отмытую суспензию нужных микроорганизмов.

Затем через определенные промежутки времени такая почва высевается в виде отдельных комочков на агаровые пластинки в чашках Петри, предварительно засеянные тем же самым организмом, который использовался для обогащения почвы.

Метод центрифугирования почвенной суспензии. Для выделения стрептомицетов из почв, и особенно из почв в весеннее время, когда в ней развивается большое число грибов и бактерий, применяют метод центрифугирования почвенной взвеси. Метод основан на различии скоростей оседания отдельных видов микроорганизмов в центробежном поле. При 3000 об/мин в течение 20 мин частицы, соответствующие по размерам спорам плесеней или клеткам бактерий типа В. Частицы же, соответствующие по размерам спорам или отдельным обрывкам мицелия стрептомицетов, при данной скорости центрифугирования оказываются в поверхностном слое жидкости.

Высевая надосадочную жидкость, в большинстве случаев (до 92\%) на пластинках питательного агара удается получить только колонии актиномицетов.

Метод замораживания-оттаивания почвы. Известно, что в почве микроорганизмы находятся в адсорбированном на частицах состоянии. Для полноты десорбции микроорганизмов с почвенных частиц применяют химические методы, при которых почвенные образцы обрабатывают различными детергентами, и физические, в основе которых лежит метод механического растирания образцов почвы.

Для лучшей десорбции микроорганизмов с почвенных частиц рекомендуется использовать метод замораживания-оттаивания почвы. Суть метода состоит в следующем. Отобранный для выделения стрептомицетов образец почвы помещают в испаритель бытового холодильника при температуре -8 °С. Через час образец извлекают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре до полного оттаивания. Процедуру замораживания-оттаивания повторяют дважды. Затем навеску почвы помещают в стерильную воду, взбалтывают суспензию в течение 15 мин на круговой качалке при 230 об/мин, после чего различные разведения суспензии высевают на питательную агаровую пластинку в чашках Петри.

Метод замораживания-оттаивания образцов почвы позволяет обнаружить в них в 1,2-3,6 раза больше стрептомицетов, чем в тех же образцах без замораживания.

Обработка почвенного образца карбонатом кальция. Увеличение числа выделенных культур стрептомицетов примерно на два порядка наблюдается при обработке почвенного образца карбонатом кальция и при инкубировании во влажных условиях. Впервые метод был предложен П. Тсао с соавторами в 1960 г. и модифицирован И.В. Алферовой и Л.П. Тереховой в 1988 г. Образец почвы смешивают с порошком карбоната кальция в соотношении 10: 1 и инкубируют во влажной камере при температуре 28 °С. Влажность обеспечивается путем помещения в чашки Петри кусочков фильтровальной бумаги, пропитанных дистиллированной водой и прикрепленных к крышке чашки.

Увеличение общего числа выделяемых актиномицетов из таких образцов почвы, по-видимому, связано с тем, что ионы кальция инициируют прорастание спор стрептомицетов.

Применение питательных сред, содержащих антибиотики. Высев почвенной суспензии на агаровые пластинки вызывает трудности для развития редко встречающихся видов актиномицетов в результате быстрого размножения бактерий и широко распространенных в почвах видов актиномицетов. Поэтому для направленного выделения определенных групп микроорганизмов в среды для высева почвенной суспензии добавляют различные антибиотики. При добавлении антибиотиков к среде для культивирования микроорганизмов обычная микрофлора подавляется и создаются условия для развития устойчивых к этим антибиотикам форм микробов; последние могут оказаться новыми или редкими видами, способными образовывать и новые антибиотики. Для этих целей часто используют антибактериальные и противогрибные препараты.

Для выделения актиномицетов применяют среды, содержащие в своем составе такие антибиотики, как тетрациклины, неомицин, нистатин, стрептомицин, хлорамфеникол, пенициллин и др.

При выделении продуцентов новых антибиотических веществ используют среды, содержащие стрептомицин в концентрациях от 25 до 100 мкг/мл и рубомицин — от 5 до 20 мкг/мл. В случае добавления к среде стрептомицина значительно подавляется рост наиболее часто встречающихся видов S. griseovariabilis, S.flavochromogenes, S. griseolis, S. aureofaciens, S. griseus и др. и выделяются виды актиномицетов, которые не обнаруживались на той же среде без стрептомицина. С повышением концентрации стрептомицина в среде общее количество выделяемых стрептомицетов уменьшается, однако при этом вырастают новые виды актиномицетов.

Внесение в среду для высева почвенной суспензии рубомицина в значительной степени подавляет рост стрептомицетов и нокардиа. Довольно устойчивы к этому антибиотику представители секций Roseus, Helvolo-Flavus и Albus. В указанных условиях в значительном количестве вырастают виды стрептомицетов, не образующие воздушный мицелий. Продуценты, например, аминогликозидных антибиотиков могут быть найдены, как правило, только среди стрептомицетов, устойчивых к действию этих антибиотиков.

Большое внимание уделяется поиску новых антибиотиков, образуемых сравнительно небольшим родом актиномицетов Micromonospora. Их редкая встречаемость в природных источниках (почва, илы) потребовала разработки соответствующих методов их выделения. По предложению М.В. Бибиковой, Л.П. Иваницкой и др. (1989) для выделения микромоноспора применяют селективные среды, содержащие 1 мкг/мл гентамицина, который подавляет рост быстрорастущей микрофлоры, в том числе и стрептомицетов. Это дает возможность в 2-3 раза повысить число развивающихся колоний микромоноспора и при этом в 3 раза увеличить число штаммов, способных вырабатывать антибиотики.

Представителей рода Actinomadura обычно выделяют из почв на богатых питательных средах, содержащих антибиотики.

Обработка почвенной суспензии УФ-светом. Для селективного выделения определенных групп актиномицетов наряду с другими методами используют метод предварительной обработки природных субстратов физическими факторами. Известно, что различные группы актиномицетов обладают неодинаковой чувствительностью к ультрафиолетовому (УФ) облучению.

O.A. Галатенко и Л.П. Терехова (1990) для преимущественного выделения из почвы редких видов актиномицетов (Mycromonospora, Nocardiopsis, Amycolatopsis) предложили метод предварительного облучения почвенной суспензии УФ-светом.

Почвенную водную суспензию, разведенную в зависимости от образца почвы в отношении 1: 102, 1: 103, 1: 104, в количестве 0,05 мл наносят на поверхность агаровой пластинки в чашке Петри и облучают УФ-светом с помощью бактерицидной лампы БУВ-15. Облучение проводят на расстоянии 20 см от источника света в течение 30 с — 2 мин. При такой обработке почвенной суспензии снижается выделение актиномицетов и увеличивается развитие представителей редких родов.

Использование СВЧ (волн сверхвысокой частоты). Т.И. Булина и др. (1999) для выделения из почвы редких видов актиномицетов предложили следующий метод.

Образец почвы растирают в ступке, просевают через сито и перемешивают. 1 г почвы суспендируют в 100 мл воды, встряхивают в течение 10 мин и разводят 1: 1000. В стерильные пробирки переносят по 2,5 мл суспензии и обрабатывают волнами СВЧ. Для этого можно использовать микроволновую печь марки «Р1Шоп» с рабочей частотой 2640 МГц.

Наилучший эффект наблюдается при режиме облучения суспензии мощностью 80 Вт в течение 30 с. При этих параметрах обработки суспензии СВЧ-волнами споры актиномицетов проявляют наибольшую устойчивость.

Облученную почвенную суспензию разводят дистиллированной водой в 10 раз и высевают на поверхность агаровой среды по 0,05 мл на чашку. Используют среды с антибиотиком леворином (в концентрации 20 мкг/мл для ингибирования роста грибов) и налидиксовой кислотой, т.е. нефторированным хинолоном (10 мкг/мл — для подавления роста эубактерий, обладающих стелющим ростом) и без них. При этом наблюдается увеличение выделения форм редких родов актиномицетов.

Как уже отмечалось, по мнению некоторых микробиологов, к настоящему времени выделено и изучено не более 0,01\% всех имеющихся в природе микроорганизмов. Поэтому необходимо изучать и разрабатывать новые приемы выделения микробов, которые бы способствовали максимальному обнаружению их в природе.

Биосинтез антибиотиков

Стадия биосинтеза (образования) антибиотика. Это основная биологическая стадия сложного процесса получения антибиотического вещества. Главная задача на этой стадии — создание оптимальных условий для развития продуцента и максимально возможного биосинтеза антибиотика.

Высокая результативность стадии зависит от уровня биосинтетической активности продуцента антибиотика, времени его максимального накопления, стоимости сред для культивирования организма, в том числе стоимости применяемых предшественников, а также общих энергетических затрат на процессы, связанные с развитием продуцента антибиотического вещества.

Для максимального выхода антибиотика при культивировании продуцента используют комплекс мер, включающий подбор наиболее благоприятных для этих целей питательных сред и режимов культивирования организма. Весь этот комплекс мер включается в понятие управляемый биосинтез.

В промышленных условиях управляемый биосинтез требует строгого соблюдения технологического процесса как на этапе подготовки инокулята, так и на стадии биосинтеза. При подготовке инокулята особое внимание обращают на состав среды, на которой выращивается организм, на возраст клеток или мицелия. На стадии биосинтеза кроме состава среды большую роль играют скорость потребления тех или иных ее компонентов, предшественники, регуляция процесса аэрации культуры, поддержание соответствующих температуры и рН среды и другие показатели режима культивирования.

Стадия предварительной обработки культуральной жидкости, клеток (мицелия) микроорганизма и фильтрации (отделения культуральной жидкости от биомассы продуцента). Эффективность стадии во многом определяется составом среды для выращивания продуцента антибиотика, характером его роста, местом основного накопления биологически активного вещества (в культуральной жидкости или внутриклеточно).

Стадия выделения и очистки антибиотика. На этой стадии в зависимости от свойств антибиотика, его химического строения и основного места накопления антибиотического вещества применяются различные методы выделения и очистки. В качестве основных методов используются экстракция, осаждение, сорбция на ионообменных материалах, упаривание, сушка.

Особенность этой технологической стадии определяется тем, что на первом этапе работы приходится иметь дело с небольшой концентрацией (не более 1\%) антибиотика в обрабатываемом растворе, тогда как на последующих этапах его концентрация увеличивается до 20-30\%. Все это требует применения различных емкостей и объемов используемых реагентов.

Стадия получения готовой продукции, изготовление лекарственных форм, расфасовка. Особенность стадии определяется очень высокими требованиями к качеству конечного продукта. При химической очистке антибиотических веществ необходимо соблюдать безукоризненную чистоту помещений, оборудования, проводить их систематическую дезинфекцию. В случае выпуска антибиотиков, предназначенных для инъекций, препараты должны быть стерильными; получение таких антибиотических препаратов, приготовление различных лекарственных форм, дозировку (расфасовку) и упаковку следует проводить в асептических условиях. Расфасовка должна соответствовать запросам медицинских работников, связанным с удобством применения антибиотиков на практике.

В условиях промышленного производства антибиотиков принимают меры к максимальному снижению себестоимости препаратов путем интенсификации всех стадий технологического процесса, и прежде всего повышения эффективности первой стадии — биосинтеза антибиотического вещества. Для этого необходимо:

а) внедрение в производство наиболее высокопродуктивных штаммов микроорганизмов — продуцентов антибиотиков;

б) создание и обеспечение самых благоприятных условий развития продуцента антибиотика на относительно дешевых средах;

в) широкое использование математических методов планирования процесса развития организма и электронно-вычислительной техники в целях оптимизации и моделирования условий его культивирования, обеспечивающих максимальный выход антибиотика;

г) применение современного оборудования на всех стадиях технологического процесса с автоматизированными контролирующими устройствами основных параметров развития организма и стадий биосинтеза антибиотика.

Вместе с этим необходимы повышение качества выпускаемых антибиотиков, их стандартизация.