Тема: Проведение анализа ЛС с применением современной аппаратуры:

- хроматографические методы (ТСХ, ВЖХ, ГХ).

 

Сегодня мы ознакомились с химическими и физико-химическими методами проведения анализа ЛС, такими как:

- тонкослойная хроматография (ТСХ);

- высокоэффективная жидкостная хроматогроафия (ВЭЖХ);

- газовая хроматография (ГХ).

 

  Тонкослойная хроматография (ТСХ) является планарной разновидностью жидкостной хроматографии, в которой подвижная фаза двигается в пористой структуре адсорбента.

 

 

    Общие сведения

Процесс подобен бумажной хроматографии, но его преимуществом является большая скорость анализа, более высокое качество разделения, и возможность выбора одной из неподвижных фаз, обладающей наиболее подходящими свойствами. В настоящий момент тонкослойная хроматография (ТСХ) является одним из основных методов анализа смесей органических веществ в научных лабораториях и полностью вытеснил бумажную хроматографию.

  

  Техника

 

Пластина с нанесенными каплями образцов (смесь красного и синего компонента) в процессе разделения.

 

  Варианты тонкослойной хроматографии

Самым простым вариантом планарной хроматографии является бумажная хроматография, когда разделение производят с использованием специальной бумаги.

Для разделения используется пластины на основе оксида алюминия и силикагеля. Наиболее распространены пластины на основе силикагеля. Оксид алюминия и силикагель, как правило, размещается на стеклянной, металлической или пластиковой основе. В ряде случаев к сорбенту добавляется флуоресцентный индикатор синего или зеленого цвета. Также существуют NH₂-, CN-, ДИОЛ, и RP модифицированные сорбенты для анализа веществ не разделяющихся на силикагелях напрямую. Разделение, как правило, производится в специальных герметичных камерах для ТСХ.

Препаративная и аналитическая ТСХ

Аналитическая ТСХ является качественным методом анализа веществ. Необходимо помнить, что интенсивность цвета пятен далеко не всегда является даже приблизительной количественной характеристикой. Такая оценка возможна при использовании универсальных проявителей, тогда детектирование производится визуально, либо с помощью денситометра.

 

Препаративная ТСХ является методом выделения вещества или группы близких веществ из смеси. В этом случае наносится на старт в виде сплошной полосы. Далее отрезается край пластины (или закрывается вся остальная часть) и производится проявление. Часть пластины, соответствущая целевому веществу соскребается, вещество отделяется от сорбента. Препаративную ТСХ следует использовать, если в лаборатории нет высокоэффективного жидкостного хроматографа.

Фотогалерея

Развитие процесса хроматогирования во времени:

 

 

 

ВЭЖХ, ГХ

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, англ. HPLC, High performance liquid chromatography) — один из эффективных методов разделения сложных смесей веществ, широко применяемый как в аналитической химии, так и в химической технологии. Основой хроматографического разделения является участие компонентов разделяемой смеси в сложной системе Ван-дер- Ваальсовых взаимодействий (преимущественно межмолекулярных) на границе раздела фаз. Как способ анализа, ВЭЖХ входит в состав группы методов, которая, ввиду сложности исследуемых обьектов, включает предварительное разделение исходной сложной смеси на относительно простые. Полученные простые смеси анализируются затем обычными физико-химическими методами или специальными методами, созданными для хроматографии.

 

Принцип жидкостной хроматографии состоит в разделении компонентов смеси, основанном на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна.

 

Отличительной особенностью ВЭЖХ является использование высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (обычно 3 – 5 мкм, сейчас до 1,8 мкм). Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа от 3 до 30 мин).

 

Метод ВЭЖХ находит широкое применение в таких областях, как химия, нефтехимия, биология, биотехнология, медицина, пищевая промышленность, охрана окружающей среды, производство лекарственных препаратов и во многих других.

 

По механизму разделения анализируемых или разделяемых веществ ВЭЖХ делится на адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, лигандообменную и другие.

 

Следует иметь в виду, что в практической работе разделение часто протекает не по одному, а по нескольким механизмам одновременно. Так, эксклюзионное разделение бывает осложнено адсорбционными эффектами, адсорбционное – распределительными, и наоборот. При этом чем больше различие веществ в пробе по степени ионизации, основности или кислотности, по молекулярной массе, поляризуемости и другим параметрам, тем больше вероятность проявления другого механизма разделения для таких веществ.

                                  Нормально – фазовая ВЭЖХ

Неповижная фаза более полярна, чем подвижная, поэтому в составе элюента преобладает неполярный растворитель:

 

· Гексан: изопропанол = 95:5 (для малополярных веществ)

· Хлороформ: метанол = 95:5 (для среднеполярных веществ)

· Хлороформ: метанол = 80:20 (для сильнополярных веществ)

 

 Обращенно – фазовая ВЭЖХ

Неподвижная фаза менее полярна, чем подвижная, поэтому в составе элюента почти всегда присуствует вода. В этом случае всегда можно обеспечить полное растворение БАС в подвижной фазе, почти всегда возможно использовать УФ – детектирование, почти все подвижные фазы взаимно смешиваются, можно использовать градиентное элюирование, можно быстро переуравновесить колонку, колонку можно регенерировать.

 

Обычными элюентами для обращенно-фазовой ВЭЖХ являются:

· Ацетонитрил:вода

· Метанол:вода

· Изопропанол: вода

Прививки неподвижной фазы

Нормально – фазовая ВЭЖХ:

 

· Неподвижная фаза с пропилнитрильной прививки (нитрильной);

· Неподвижная фаза с пропиламинной прививкой (аминной).

Обращенно – фазовая ВЭЖХ:

 

· Неподвижная фаза с алкильной прививкой;

· Неподвижная фаза с алкилсилильной прививкой.

Энд – кэппирование – защита непривитых участков сорбента дополнительной прививкой «маленькими» молекулами. Гидрофобный энд – кэппинг (С1, С2): выше селективность, хуже смачиваемость; гидрофильный энд – кэппинг (диол): ниже селективность, выше смачивемость.

 

                                              Детектор для ВЭЖХ

 

· Ультрафиолетовый

· Фотодиодно – матричный

· Флуориметрический

· Электрохимический

· Рефрактометрический

· Масс – селективный

                                                   Газовая хроматография

Газовая хроматография – разновидность хроматографии, метод разделения летучих компонентов, при котором подвижной фазой служит инертный газ (газ – носитель), протекающий через неподвижную фазу с большой поверхностью. В качестве подвижной фазы используют водород, гелий, азот, аргон, углекислый газ. Газ – носитель не реагирует с неподвижной фазой и разделяемыми веществами.

 

Различают газо – твердофазную и газо – жидкостную хроматографию. В первом случае неподвижной фазой является твердый носитель (силикагель, уголь, оксид алюминия), во втором – жидкость, нанесенная на поверхность инертного носителя.

 

Газо – жидкостная хроматография – разделение газовой смеси вследствие различной растворимости компонентов пробы в жидкости или различной стабильности, образующихся комплексов. Неподвижной фазой служит жидкость, нанесенная на инертный носитель, подвижной – газ.

 

Разделение основано на различиях в летучести и растворимости (или адсорбируемости) компонентов разделяемой смеси.