Классификация плазмид (по функциям):

1. Криптические плазмиды
Природные плазмиды - состоят из одного основного репликона - не оказывают влияния на фенотип клетки хозяина. Не известно за какие функции они отвечают.

2. Эписомы - Особые плазмиды - способны встраиваться в бактериальную хромосому.
Некоторое время могут существовать отдельно от хромосомы.

3. R-плазмиды резистентности (R-resistance)
Нерациональное использование АМП привело к распространению устойчивых к ним бактерий.
Устойчивость к АМП обусловлена генами в составе R-плазмид – резистентности
R-плазмиды могут передавать устойчивость одновременно к нескольким (до 10) АМП и металлам. Именно R-плазмиды определяют устойчивость бактерий в окружающей среде.

4. Плазмиды вирулентности (PV).
Несут гены, определяющие вирулентность (степень патогенности). Плазмиды E.coli могут содержать гены энтеротоксинов.
Обусловливают образование пилей, способствующих адгезии – 1-го фактора патогенности.

5. Плазмиды бактериоцинов.
Кодируют белки - бактериоцины, вызывающие гибель других бактерий, что позволяет бактериям выжить в борьбе за существование.
Бактериоцины: обладают антагонистическим воздействием на бактерии того же или других видов, не оказывают воздействия на клетки, продуцирующие белки-бактериоцины.
E.coli – колицины, Y.pestis – пестицины, лактобациллы– лактоцины.

Механизм действия бактериоцинов: ( Мишени воздействия различны!)

Колицин Е1 – повышает проницаемость ЦПМ
Колицин Е2 – вызывает деградацию ДНК
Колицин Е3 – разрушает рибосомальную РНК.

6. Плазмиды деградации
Обеспечивают метаболитическую деструкцию (биодеградацию) различных веществ- ксенобиотиков. Бактерии рода Pseudomonas биодеградируют углеводороды, нефтепродукты, различные пестициды.

7. Плазмиды F–фертильности.
Передача F-плазмиды происходит при конъюгации с клеткой, в которой такой плазмиды нет. F–плазмида может находиться в составе хромосомы.
При переходе в другую клетку она может захватывать с собой другие гены.

Вопрос 6. Способы передачи генетической информации

Быстрая реакция на изменения условий окружающей среды и приобретение необходимых генетических признаков (напр. изменение вирулентных свойств, устойчивость к АМП). Обмен генетической информацией (ОГИ)- механизм, обеспечивающий многообразие микробного мира.

ОГИ способствует быстрой адаптации бактерий.
ОГИ приводит к образованию рекомбинантной ДНК.
ОГИ служит важным фактором эволюции бактерий.

3 способа передачи генетической информации:

1. Конъюгация – внедрение ДНК из бактерии – донора в клетку реципиента
2. Трансформация – поглощение свободной ДНК из внешней среды
3. Трансдукция – распространение генов бактерий умеренными фагами

Схема конъюгации

Вопрос 7. Конъюгация

Конъюгация – однонаправленный перенос генетического материала (хромосомной и плазмидной ДНК) от донора к реципиенту при непосредственном контакте клеток.
Донор – бактерия, содержащая конъюгативную плазмиду или конъюгативный транспозон, способная передавать ДНК реципиенту путем горизонтального переноса генов.
Реципиент – любая бактериальная клетка, способная принимать ДНК от бактерии-донора путем горизонтального переноса генов.

Механизм передачи конъюгативных плазмид между Гр- бактериями:
1. Образование межклеточного контакта - конъюгативных пилей
2. Сайт-специфическое разрезание одной цепочки ДНК
3. Сборка особой структуры - релаксосомы для переноса ДНК
4. Перемещение разделенных цепей ДНК в клетку реципиента
5. Синтез комплементарных цепей ДНК
6. Терминация переноса ДНК и разделение конъюгирующих клеток

Вопрос 8. Трансформация

Трансформация - поглощение бактерией ДНК из окружающей среды и включение в свой геном, при этом бактерия становится генетически трансформированной.
Впервые этот феномен описан у Streptococcus pneumoniae, когда непатогенные живые мутантные клетки стали патогенными для мышей при одновременной инъекции с убитыми нагреванием вирулентными клетками S.pneumoniae.
Изменение происходило в результате трансформирующего действия ДНК из убитых нагреванием вирулентных клеток S.pneumoniae.

Схема трансформации
1. Адсорбция ДНК на клетке (клеточной стенке)
2. Проникновение внутрь клетки
3. Рекомбинация с ДНК клеточной хромосомы

Вопрос 9. Трансдукция

Трансдукция - обмен генетическим материалом с участием бактериофагов.
Бактериофаги – вирусы бактерий - молекулярные паразиты, использующие для самовоспроизводства аппарат репликации ДНК и синтеза белка зараженных ими клеток.

Трансдукцию осуществляют бактериофаги, содержащие невирусную генетическую информацию. Подобно плазмидам, бактериофаги могут выступать в качестве векторов переноса ДНК от клеток-хозяев.  Перенос фаговой информации может служить механизмом обмена генетическим материалом между бактериями. Бактериофаги E.coli

Виды трансдукции:
1. Специфическая трансдукция – перенос генов клетки-хозяина из строго определенных участков хромосомы бактериальной клетки. (Например, 5 из 11 фагов возбудителя дифтерии Corynebacterium diphtheriae – переносчики генов дифтерийного токсина).
2. Неспецифическая трансдукция (общая) - случайный перенос различных генов клетки-хозяина, расположенных в разных участках генома бактерии.. Схема трансдукции

Вопрос 10. Включения в цитоплазму

В цитоплазме бактерий могут находиться включения - нерастворимые продукты клеточного метаболизма. Основная функция: запасание питательных веществ, хранение метаболитов при их избыточном образовании.
Клеточные включения не имеют существенного значения для метаболизма, но обеспечивают преимущество на отдельных стадиях роста и в особых условиях обитания. Часто включения составляют значительную долю бактериальных клеток.
Метахроматин в клетках возбудителя дифтерии. Клетки бактерий с крупными жировыми каплями. Газовые вакуоли почвенной бактерии Renobacter vacuolatum
Химический состав включений: включения могут иметь различную химическую природу:
Полисахариды, Полифосфатные гранулы – волютин, Глобулы серы, Глобулы жирных полигидроксикислот, Белки  Ультратонкий срез клетки Corynebacterium diphtheriae. Зерно волютина

Размножение бактерий – Л5

 Вопрос 1. Размножение бактерий (клеточный цикл)

У всех живых организмов рост клеток – это увеличение массы и последующее деление с образованием двух идентичных клеток. Не являются исключением и бактерии.
У бактерий генетический материал - в ковалентно замкнутой кольцевой молекуле ДНК.
Молекула ДНК – хромосома. Хромосома расположена в нуклеоиде.

Деление клетки Neisseria gonorrhoeae

Период от деления до деления называется вегетативным клеточным циклом (ВКЦ), он включает несколько этапов:
Репликация ДНК – удвоение генетического материала
Расхождение двух наборов хромосом
Деление клетки

Особенности клеточного цикла прокариот: ВКЦ прокариот и эукариот во многом сходен. Однако есть отличие: Во время быстрого роста в одной бактериальной клетке может происходить 2 - 3 цикла репликации хромосом одновременно.

3 этапа (В, С, Д) клеточного цикла E. coli. До начала деления клетка накапливает массу и объем.
Затем наступает период деления:
В – не происходит синтез ДНК.
С – репликация ДНК – 42 мин.
Д – расхождение дочерних хромосом - 64-67 мин.
Деление клетки – 22-25 мин.

Главное условие деления клетки - удвоение ДНК!!!

Вопрос 2. Начальные стадии репликации ДНК

Наиболее изучен первый этап клеточного цикла – репликация ДНК
Репликация ДНК: инициация, элонгация, терминация

Инициация репликации включает 3 стадии:

1) Узнавание точки начала репликации - oriC
Репликация начинается с одной точки начала репликации - oriC. Кольцевые бактериальные хромосомы реплицируются в двух направлениях. Репликация идет за счет нескольких вилок репликации, но всегда начинается с точки начала репликации – oriC
время репликации у E. coli - 20 мин
Чем чаще возникают вилки репликации, тем быстрее будет бактерия размножаться. Новая вилка репликации возникает, когда предыдущая репликация еще не завершена. Существует механизм регуляции частоты образования вилок репликации (несколько различных белков)

Синтез РНК-затравки

Подготовку к синтезу РНК-затравки -праймера осуществляют белковые комплексы – праймосомы: DnaA, Dna В и Dna С. DnaA (инициаторный белок) – выполняет главную роль - соединение в точке начала репликации – oriC. После связывания DnaA с 2Н ДНК к этому участку присоединяются белки Dna В и Dna С.

3) Связывание ДНК-геликазы с матрицей ДНК. Приводит к раскручиванию 2Н ДНК

Вопрос 3. Элонгация и терминация

За этапом инициации репликации следуют:
Элонгация - рост реплицирующегося фрагмента (репликона). существуют различия в репликации цепей ДНК.
1-я цепь (ведущая) – синтезируется непрерывным способом.
2-я цепь (отстающая) – синтезируется прерывисто путем образования фрагментов Оказаки, которые далее соединяются лигазой.
За такой синтез отвечают холоферменты (от англ. – объединяющие): ДНК-полимераза I, ДНК-полимераза III
Терминация - окончание процесса синтеза. Завершение репликации происходит в точке terC. после завершения репликации бактериальная клетка переходит к следующему - 2-му этапу клеточного цикла - расхождению хромосом

Вопрос 4. Расхождению хромосом

Расхождение хромосом: в процессе репликации и разделения цепей ДНК происходит конденсация и суперспирализация непосредственно после завершения репликации 2 дочерние хромосомы спутаны и сцеплены, чтобы разделиться они должны быть расцеплены затем хромосомы расходятся в стороны – в центры будущих дочерних клеток.
Расхождение хромосом бактерий - соответствие митозу эукариот.
 У бактерий нет микротрубочек как у эукариот в митозе, аналогов центромер у бактерий пока не обнаружено

Схема 1. Классическая схема Мано - перетягивание хромосом за счет активности мембран.
Мембрана растет, увеличиваясь на участке прикрепления ДНК, что приводит к ее перемещению
Схема 2. С помощьюбелков, генерирующих растяжение (белковый аналог аппарата веретена деления)

Вопрос 5. Бинарное мономорфное деление клеток.

Бинарное деление материнской клетки и расхождение 2-х дочерних клеток происходит в конце периода Д(послерасхождения дочерних хромосом).
Сначала в середине клетки образуется инвагинация ЦПМ и клеточной стенки.
Процесс активируется пенициллин-связывающим белком Pbp 3 (принимает участие в синтезе пептидогликана клеточных перегородок). в центре клетки образуется специфическая белковая структура – перисептальное кольцо

Перисептальное кольцо (септа – перегородка) образуется в центре клетки непосредственно перед началом деления, состоит из молекул одного белка FtsZ, экспрессия которого связана только с определенным этапом клеточного цикла.

FtsZ – белок близок к белкам эукариот – тубулинам, из которых образуются микротрубочки в митозе. В норме образование перегородок происходит в центре клеток. У мутантов в локусе minB локализация перегородок нарушена, образуется 1 круглая mini-клетка без ДНК, а другая удлиненная – содержит всю материнскую ДНК.

Образование поперечной перегородки в делящейся клетке S. pyogenes
а — образующаяся перегородка; б — нуклеоид; в — клеточная стенка.

Мономорфное деление M. lysodeikticus
- после разделения материнской бактериальной клетки образуются две одинаковые дочерние клетки.
Нет материнской и дочерней клеток – это мономорфное деление – т.е. деление, при котором образуются две равноценные клетки. пример бессмертия!!!

  2-й вариант мономорфного деления - перетяжкой. Миксобактерии рода Polyangium

Вопрос 6. Дифференцировка клеток (диморфный тип деления)

У почкующихся бактерий: p. Hyphomicrobium, p. Caulobacter

Диморфный клеточный цикл:
- у бактерий p. Hyphomicrobium: Материнская клетка дает начало почке – дочерней клетке. Хромосома проходит через гифу.
- у бактерий p. Caulobacter, водные стебельковые бактерии. Бактерия – мать может дать начало 4 дочерним клеткам. Деление происходит с образованием двух различных клеток:

1. свободноживущей клетки (дочь или швермерная клетка)
2. стебельковой клетки (прикрепляется к поверхности.

Споруляция – особая форма дифференцировки клеток, можно отнести к диморфному клеточному циклу.
Начинается с ассиметричного деления клетки и образования 2-х компартментов:
- предспоры (развивается в эндоспору)
- материнской клетки (после формирования споры лизируется, высвобождая эндоспору).

Bacillus anthracis в центре спорообразующие клетки; Образование споры Bacillus subtil is

Вопрос 7. Образование эндоспор

Дифференцировка приводит к образованию клеток с различными функциями. Формируется особый тип клеток - покоящиеся формы (споры) – устойчивы к неблагоприятным воздействиям.
Споры образуют в основном Гр(+) бактерии: 6 родов: Bacillus, Clostridium, Streptomyces и др.
Недавно описали новую Гр(-) спорообразующую бактерию р. Sporomasa (имеет форму банана)

Стадии образования спор на примере B. Subtilis:
В оптимальных условиях роста клетки B. subtilis размножаются путем бинарного деления, при котором образуется септа (перегородка) в центре материнской клетки.
При исчерпании питательного субстрата и высокой плотности популяции появляется первый признак споруляции – ассиметрично расположенная перегородка (спорулирующая септа) – наступает 1-я стадия образования спор.
После формирования септы начинается 2-я стадия: клетка делится септой на 2 части:
1 – большой клеточный компартмент - развивается материнская клетка
2-й - меньший компартмент – будущая спора.
Мембраны материнской клетки окружают меньший компартмент, формируя двойную мембрану вокруг предспоры.
3 стадия - образуется протопласт предспоры, покрытый 2-х мембранной структурой (зародышевой клеточной стенкой).
4 стадия- между двумя мембранами откладывается пептидогликан – происходит образование кортекса споры.
5 стадия – сборка белковых покровов споры.
6-я (стадия созревания) - спора становится устойчивой к действию физико-химических факторов и приобретает свойства покоящейся формы, а также в будущем способность к прорастанию.
На последней 7-й стадии происходит лизис материнской клетки с освобождением споры – обезвоженной покоящейся формы клетки, сильно преломляющей свет.

Вопрос 8. Строение эндоспор

В сердцевине: дипиколиновая кислота, ионы Са2⁺ (цементируют сердцевину споры), низкомолекулярные белки (связываются с молекулой ДНК, придавая ей стабильность). Сердцевина обезвожена и окружена мембранами (активной функции не выполняют), затем слой муреина – кортекс (в дальнейшем послужит основой клеточной стенки), все окружает эндоспориум (вещества различной химической природы)

Схема строения споры 1 — эндоспориум; 2 — слои споровой оболочки; 3 — внешняя мембрана споры; 4 — кора (кортекс- пептидогликан); 5 — внутренняя мембрана споры; 6 — сердцевина.

Вопрос 9. Функции эндоспор

Бактерии в состоянии споры способны выдерживать стресс, при этом сохраняя жизнеспособность
Бактериальная спора практически лишена воды, поэтому, находясь в состоянии покоя, устойчива к различным воздействиям: химические вещества, температура (низкая и высокая), частично УФ-излучение. споры термофильной бактерии Thermoactinomyces пролежали 110 лет в илах, воде и т.д.

Споры Bacillus circulaus пролежали 350 000 000 лет в отложениях соленых высохших озер.

Вопрос 10. Прорастание эндоспор

Для прорастания спор нужно снять внутренний и внешний покой (напр. нагреванием - чтобы рецепторы споры восприняли сигнал). Для Bacillussubtilis сигналом служит аминокислота –аланин, при ее добавлении в среду споры начинают прорастать. Для других бактерий сигналы: глюкоза, фруктоза, ионы К⁺. Механическая стимуляция прорастания спор вызывает: нарушение структуры оболочек, инициацию репарации ДНК, репликацию ДНК.
В результате из споры может образоваться новая бактериальная клетка.