Шаг 1. Приготовьте буферные растворы

 

Мы рекомендуем вам использовать градуированные цилиндры на 100 мл и на 1 л для приготовления растворов. Вам также понадобится 1 л дистиллированной воды.

 

Буфер	Объем	Реагент	Используется для
1х PBS, 100 мл	90 мл	Дистиллированная вода	Приготовления стоковых (50x) растворов антигена, первичных и вторичных антител Разведение антигена для приготовления положительного контроля и образца известной концентрации. Приготовление образцов для учеников Отрицательный контроль Приготовление серии разведений известной концентрации.
	10 мл	10х PBS
Промывочный буфер, 900 мл	805 мл	Дистиллированная вода	Разведение 50x растворов антител Промывка плашек
	90 мл	10х PBS
	4.5 мл	10% Твин 20

 

Шаг 2. Приготовьте стоковые растворы антигена и антител

 

Осторожно откройте флаконы с лиофилизованными антигеном и антителами и чистой пипеткой добавьте 0.5 мл 1x PBS в каждый из них. Закройте флаконы и хорошо перемешайте. Получившиеся растворы это 50-кратные концентраты, или «стоковые» растворы. Внимание: на этом этапе не используйте промывочный буфер.

 

Шаг 3. Разведите 50-кратные растворы

 

Подготовьте по 50 мл бутылке или пробирке для растворов антигена, первичных и вторичных антител. Подготовьте по 15 мл пробирке для образцов учеников «А» и «Б». Используйте чистую пипетку, чтобы добавить нужное количество концентрированного стокового раствора в соответствующую бутылку или пробирку.

 

Раствор	Объем	Реагент	Используется для

Х антиген

24.5 мл 1х PBS

Положительный контроль

Концентрат для приготовления образцов «А» и «Б»

Образец известной концентрации

0.5 мл 50x антиген

Внимание: не добавляйте раствор, содержащий Твин 20 в раствор антигена, иначе эксперимент не будет работать

Х раствор первичных антител

24.5 мл Промывочный буфер

Первичные антитела

0.5 мл 50х кратный раствор первичных антител

 С помощью пипетки промойте флакон с 50х раствором антител приготовленным однократным раствором, чтобы смыть остатки стокового раствора со стенок

Закройте бутыль или пробирку с приготовленным раствором крышкой и хорошо перемешайте

Х раствор вторичных антител

24.5 мл Промывочный буфер

Вторичные антитела

0.5 мл 50х раствор вторичных антител

Разводите вторичные антитела не ранее чем за сутки до начала работы

С помощью пипетки промойте флакон с 50х раствором антител приготовленным однократным раствором, чтобы смыть остатки стокового раствора со стенок

Закройте бутыль или пробирку с приготовленным раствором крышкой и хорошо перемешайте

Антиген, 125 нг/мл (раствор «А») в 15 мл пробирке

8.75 мл 1х PBS

Образец А

1.25 мл 1х антиген

Антиген, 25 нг/мл (раствор «Б») в 15 мл пробирке

9.75 мл 1х PBS

Образец Б

0.25 мл 1х антиген  

Закройте 15 мл пробирки и хорошо перемешайте

 

 

 

Шаг 4. Приготовьте аликвоты растворов для обеспечения всех рабочих мест

 

Пробирки	Описание	Подписать	Содержимое
Фиолетовые пробирки, 12 шт	Положительный контроль	«+»	0.5 мл раствора антигена (положительный контроль)
Синие пробирки, 12 шт	Отрицательный контроль	«-»	0.5 мл 1х PBS
Зеленые пробирки, 12 шт	Первичные антитела	«П.А.»	1.5 мл 1х раствора первичных антител
Оранжевые пробирки, 12 шт	Вторичные антитела	«В.А.»	1.5 мл 1х раствора вторичных антител
Коричневые пробирки, 12 шт	Субстрат пероксидазы (ТМБ)	«Субстрат»	1.5. мл раствора ТМБ
	Внимание: ТМБ чувствителен к свету, поэтому важно хранить его именно в темных пробирках.
Желтые пробирки, 12 шт	Образец известной концентрации	«Антиген, 1000 нг/мл»	0.25 мл 1х раствора антигена
Желтые пробирки, 12 шт	1х PBS	«PBS»	1 мл 1х PBS
Желтые пробирки, 12 шт	Антиген, 125 нг/мл	«А»	0.25 мл раствора «А»
Желтые пробирки, 12 шт	Антиген, 25 нг/мл	«Б»	0.25 мл раствора «Б»

 

Шаг 5. Подготовьте рабочие места учеников

 

Список для проверки рабочих мест. Одно рабочее место рассчитано на 4 учеников

 

Предмет	Содержимое	Количество	(ü)
Желтые пробирки (А и Б)	Образцы для анализа (0.25 мл)	2 шт	q
Желтые пробирки (Антиген, 1000 нг/мл)	1х антиген (0.25 мл)	1 шт	q
Желтые пробирки (PBS)	1x PBS (1 мл)	2 шт	q
Фиолетовая пробирка (+)	Положительный контроль (0.5 мл)	1 шт	q
Синяя пробирка (-)	Отрицательный контроль (0.5 мл)	1 шт	q
Зеленая пробирка (П.А.)	Первичные антитела (1.5 мл)	1 шт	q
Оранжевая пробирка (В.А.)	Вторичные антитела (1.5.мл)	1 шт	q
Коричневая пробирка (Субстрат)	Субстрат пероксидазы (ТМБ) 1.5 мл	1 шт	q
12-луночные стрипы		2 шт	q
Микропипетка		1 шт	q
Желтые носики для микропипетки		10-20 шт	q
Одноразовые пластиковые пипетки		1шт	q
70-80 мл промывочного буфера в стакане	Фосфатно-солевой буфер (PBS), содержащий 0.05% Твин 20	1 шт	q
Большая пачка бумажных полотенец		2	q
Черный фломастер (маркер)		1 шт	q