Автоматическое растормаживание колес: Тормозные устройства колес предназначены для уменьшения длины пробега и улучшения маневрирования ВС при...
История создания датчика движения: Первый прибор для обнаружения движения был изобретен немецким физиком Генрихом Герцем...
Топ:
Проблема типологии научных революций: Глобальные научные революции и типы научной рациональности...
Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов...
Интересное:
Отражение на счетах бухгалтерского учета процесса приобретения: Процесс заготовления представляет систему экономических событий, включающих приобретение организацией у поставщиков сырья...
Распространение рака на другие отдаленные от желудка органы: Характерных симптомов рака желудка не существует. Выраженные симптомы появляются, когда опухоль...
Что нужно делать при лейкемии: Прежде всего, необходимо выяснить, не страдаете ли вы каким-либо душевным недугом...
Дисциплины:
2017-05-13 | 293 |
5.00
из
|
Заказать работу |
Содержание книги
Поиск на нашем сайте
|
|
Топография куриного эмбриона (продольный разрез, 12 дней)
1. Скорлупа
2. Подскорлупная оболочка
3. Воздушная камера
4. Аллантоисная полость
5. Желточный мешок
6. Альбуминный мешок
7. ХАО – хорион-аллантоисная оболочка
8. Амниотическая полость
9. Эмбрион
10. Канатик (соединение желточного мешка с пуповиной)
Для заражения выбирают здоровые эмбрионы. Для этого проводят овоскопию. На скорлупе делают пометки карандашом – границы воздушной камеры и местоположение зародыша.
I. Заражение в аллантоисную полость.
Все операции проводят асептично с горящей газовой горелкой. Место введения обрабатывают 2% йодированным спиртом, вводят 0,1-0,2 мл жидкости. Отверстие закрывают каплей расплавленного парафина. На скорлупе пишут:
- название вируса
- дату
- фамилию
II. Заражение через искусственную воздушную камеру на ХАО.
1. Делается отверстие в области воздушной камеры.
2. Делается окошко «А»
3. Отсасывается воздух из воздушной камеры.
4. В окошко «А» капается вирус содержащая жидкость. Отверстие заклеивается лейкопластырем.
5. На скорлупе пишется название вируса, дата, фамилия.
Индикация вируса в курином эмбрионе.
1. Гибель куриного эмбриона в характерные для данного вируса сроки. Гибель эмбрионов в первые сутки не специфична. Эмбрионы погибшие в более поздние сроки переносятся в холодильник (+ 4С). Все эмбрионы извлекают из термостата в момент максимального накопления вируса. Срок для каждого вируса – справочные данные.
2. Вскрытие эмбриона и анализ патологоанатомических изменений.
- Отечная ХАО и белые узелки некроза (оспины).
- Мутность или изменение цвета аллантоисной и амниотической жидкостей. Красноватый цвет жидкостей – результат гемолиза.
|
- Изменения зародыша: карликовость, кровоизлияния, мумификация.
- Органы зародыша – некроз, кровоизлияния.
3. Наличие гемаглютинации при проведении капельной реакции ГА. (аллантоисная жидкость + 5% р-р эритроцитов кур)
Использование культуры клеток.
Культура клеток это клетки многоклеточного организма живущие и размножающиеся в искусственных условиях (in vitro).
Типы культур клеток.
Тип клеток Свойства | Частично Трипсинизированные | Перевиваемые | Диплоидные |
Происхождение | Из органов | Из первичных | Из первичных |
Продолжительность жизни | 3-5 пассажей | Неограниченное количество пассажей | Около 50 пассажей: - гибель - перевивание |
Кариотип | 2n | Xn | 2n |
Способность образовывать опухоли | - | + | - |
Этапы получения первичной культуры.
1. Берут ткань молодого животного (лучше всего эмбриона).
2. Кусочки ткани отмывают от эритроцитов в растворе Хенкса.
3. Кусочки ткани заливают теплым раствором трипсина.
4. Раствор ставят на магнитную мешалку, в колбу кладут магнит.
5. Проводят дробную трипсинизацию.
6. Раствор трипсина сливают в центрифужные пробирки. В растворе находятся отдельные клетки.
7. Центрифугация в течении 10 минут – 1000 об/мин, затем трипсин сливают.
8. Клетки помещают в питательную среду:
- среда 199
- среда Игла
- среда гидролизатлактальбумина.
9. Проводят подсчет клеток в камере Горяева
10. Клетки разводят питательной средой до посевной концентрации от 500 000 до 1 000 000 клеток на мл.
11. Добавляют 10% сыворотки КРС.
12. Разливают в пробирки, матрасы или роллерные колбы и культивируют.
13. После формирования монослоя (3-5 день) молодую культуру клеток заражают вирусом.
Лучше всего работать с диплоидными культурами клеток, так как как они свободны от контаменантов (бактерии, грибы, микоплазмы)
|
Используемые растворы.
1. раствор Хенкса (дистилированная вода, соли, антибиотики)
2. раствор Эрла (имеет несколько другой солевой состав) Эти растворы используют как солевую базу для отмывания клеток.
3. Раствор трипсина (0,25%) используют для разделения клеток, для снятия их со стекла.
4. Раствор Версена используют для снятия клеток со стекла при пересеве.
Используемые среды.
1. Среда 199 – 20 АМК, более 17 гормонов, всего 69 компонентов.
2. Среда Игла (Eagle)
3. Среда ГЛА (гидролизатлактоальбумина.
Заражение культуры клеток.
1. С выросшего монослоя сливают ростовую питательную среду.
2. Отмывают клетки от ростовой питательной среды р-ром Хенкса или Эрла.
3. Заливают вирус содержащий материал 0,1-0,2 мл.
4. Помещают в термостат (30-60 минут)
5. Вирус содержащий материал удаляют (не обязательно) и заливают поддерживающую среду.
6. Зараженную культуру ставят в термостат (37 С) и ежедневно контролируют просматривая под микроскопом.
Методу обнаружения вируса в культуре клеток.
ЦПД – цитопатическое действие.
1. Гибель клетки с округлением. Округленная клетка слабо прикрепляется к субстрату и выпадает из монослоя, который приобретает вид кружева.
2. Гибель клетки с фрагментацией.
3. Образование симпластов.
Адсорбция эритроцитов на поверхности зараженных клеток.
При проникновении вируса через клеточную оболочку в ней задерживаются вирусные белки и оболочка приобретает свойства белков вируса, а следовательно способность к ГАд.
Серологические реакции.
РИФ – реакция иммунофлюорисценции.
АГ + АТ меченные флюорохромом. Дают контакт 30 минут при 37 С, затем производят тщательный отмыв в физрастворе. Метод обнаружения – флюоресцентное свечение под микроскопом.
ИФА – иммуно-ферментный анализ.
АГ + АТ с ферментом. Контакт, отмыв, затем добавляют субстрат, который при контакте с АТ-ферментным комплексом дает цветную реакцию.
РСК – реакция связывания комплемента.
АГ + АТ + комплемент. Контакт. Затем добавляют гем-систему (гемолизин + эритроциты барана). Контакт. Если гемолиза не происходит, значит АГ и АТ связали комплемент. Задержка гемолиза – реакция положительная. Если произошел гемолиз, значит комплемент связан гем-системой – реакция отрицательная.
|
4. РДП - реакция диффузной преципитиции.
АГ + АТ (диффузия в агаровом геле). Метод обнаружения – образование контура преципитации.
РНГА – реакция непрямой гемаглютинации.
Эритроциты нагружают АГ и при образовании комплекса АГ-АТ происходит агглютинация эритроцитов.
РТГА – реакция торможения гамаглютинации
РТГАд – реакция торможения гемадсорбции
РН – реакция нейтрализации.
Вирус + АТ. Контакт. Ввод в чувствительную к вирусу систему. Метод обнаружения – нейтрализация инфекционной активности вируса.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
ПЦР является наиболее чувствительным методом. Реакция обнаруживает вирусные НК. Реакция открыта в 1985 году в США.
Сутью метода является амплификация, т.е. увеличение числа копий строго определенных фрагментов молекул ДНК in vitro. ПЦР основана на амплификации ДНК при помощи ДНК-полимеразы, которая осуществляет синтез взаимо-комплементарных цепей ДНК начиная с 2-х праймеров (затравок)
Primer – фрагмент ДНК из 20-30 нуклеотидов. Синтезированный искусственно. Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК. Обычно при ПЦР ставят от 25 до 40 циклов в зависимости от возбудителя. Каждый цикл состоит из трех этапов.
1. Денатурация. 92-95 градусов С, 20-60 секунд. Происходит разрыв водородных связей цепей ДНК.
2. Отжиг – присоединение праймеров. 50-60 градусов С, 40-60 секунд. Происходит забрасывание праймеров, нуклеотидов и ДНК-полимеразы.
3. Элонгация – достраивание цепей ДНК. 68-72 градуса С, 40-60 секунд. Число цепочек ДНК удваивается. Образовавшиеся в первом цикле цепочки ДНК служат матрицами для последующих циклов и т.д. Таким образом в каждом цикле идет удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов наработать 225-240 участков ДНК, что позволяет обнаружить их методом электрофореза.
В ПЦР используют праймеры из консервативных участков ДНК вируса, которые имеют уникальную последовательность для каждого возбудителя.
Методика постановки.
Из исследуемого материала выделяют НК, которую помещают в чистую пробирку и добавляют амплифицирующую смесь, которая состоит из:
|
- Буфера
- ДНК-полимеразы
- Раствора 2-х видов праимеров
- 4-х видов нуклеотидов
- Магний-хлорного катализатора
- Крезолового красного для визуальной оценки
- Доливают деионизированной воды.
- Сверху капают минеральное масло.
Пробирки помещают в програмируемый термостат-амплификатор и проводят амплификацию в автоматическом режиме по заданной программе для соответствующего вида возбудителя (2-3 часа). Одновременно ставят положительный и отрицательный контроль.
Регистрация результатов – детекция амплификонов. Проводят методом электрофореза в 1-2% агаровом геле в присутствии бромистого этидия, который соединяется с фрагментами ДНК и высвечивается в виде полосок при УФО (трансилюминатор).
Противовирусный иммунитет.
В понятие противовирусного иммунитета входят три категории: видовая резистентность, неспецифические клеточные и обще физиологические реакции и специфический иммунитет.
|
|
Кормораздатчик мобильный электрифицированный: схема и процесс работы устройства...
История развития пистолетов-пулеметов: Предпосылкой для возникновения пистолетов-пулеметов послужила давняя тенденция тяготения винтовок...
Автоматическое растормаживание колес: Тормозные устройства колес предназначены для уменьшения длины пробега и улучшения маневрирования ВС при...
Состав сооружений: решетки и песколовки: Решетки – это первое устройство в схеме очистных сооружений. Они представляют...
© cyberpedia.su 2017-2024 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав. Мы поможем в написании вашей работы!