Вассермана, РИБТ – реакции иммобилизации бледной трепонемы

 

Специфические АТ, обуславливающие лизис (растворение) клеток, носят название лизинов. Эти АТ применительно к бактериям называются бактериолизинами, к эритроцитам – гемолизинами и т.д.

Лизины способны проявить свое лизирующее действие на АГ только в присутствии комплемента, который является составной частью любой свежей сыворотки.

Таким образом, в основе реакции лизиса (РСК) лежит взаимодействие трех компонентов:

1) АГ (бактериальных клеток, эритроцитов, вирусов и др.);

2) специфических АТ иммунной сыворотки (бактериолизинов, гемолизинов и др.);

3) комплемента (сыворотка морской свинки).

В начале реакция идет по типу агглютинации, затем к комплексу АГ-АТ через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент. Наступает активация компонентов комплемента, которая приводит к потери подвижности бактерий (р. иммобилизации трепонем - при сифилисе), изменению формы (набухают), и, наконец, совсем растворяются (р. агглютинации-лизиса при лептоспирозе, р. лизиса - при возвратном тифе).

РСК отличается высокой чувствительностью и специфичностью и применяется для:

1) серологической диагностики (определения противомикробных антител) инфекционных заболеваний (р. Вассермана, Борде-Жангу и др.)

2) идентификации бактерии и др. микробов. Например, реакция бактериолизиса (РСК) применяется при холере с целью идентификации вибрионов.

РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых участвуют, кроме АГ и АТ, ещё гемолитическая система (р. гемолиза), выявляющая результат реакции.

РСК проводится в два этапа при участии двух систем:

первая система (тестовая) – инкубация смеси, содержащей АГ-АТ-комплемент;

вторая система (индикаторная) – гемолитическая сыворотка (гемолизины) + эритроциты – показывает исход реакции в первой системе: в случае положительного результата реакции в первой системе (образования комплекса АГ+АТ+комплемент), во второй системе не произойдет гемолиза ввиду отсутствия комплемента (эритроциты оседают на дно пробирки). В случае отрицательного результата в первой системе вторая сопровождается гемолизом, т. к. образуется комплекс эритроциты + гемолизины + комплемент (рис.33).

Для постановки РСК Борде-Жангу, которая применяется с цельюопределения антител к гонококку (N. gonorrhoeae) при хронической гонореи требуются следующие компоненты:

1.Компоненты тестовой системы:

1) испытуемая сыворотка неизвестными противогонококковыми антителами (предварительно инактивируют нагреванием при 56°С в течение 30 минут);

2) гонококковый диагностикум– взвесь убитых N. gonorrhoeae;;

3) комплемент;

2.Индикаторная (гемолитическая) система:

1) 3% взвесь эритроцитов барана (корпускулярный антиген-агглютиноген);

2) гемолитическая сыворотка;

3.физиологический раствор.

В качестве комплемента в РСК применяют свежую и высушенную сыворотку морской свинки, т. к. в крови морской свинки комплемент содержится в наибольшем количестве и присутствует постоянно, чем у др. животных. Перед постановкой РСК следует проводить титрование комплемента в реакции гемолиза (эритроциты барана, гемолитическая сыворотка, комплемент, физ. раствор) и определение рабочей дозы.

Титр комплемента – наибольшее разведение комплемента которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки.

Рабочая доза комплемента – количество комплемента, которое выше титра на 25%.

Гемолитическая сыворотка готовится путём иммунизации кроликов 50% взвесью эритроцитов барана. Полученную сыворотку инактивируют нагреванием при 56°С, определяют титр и рабочую дозу.

Титр сыворотки – максимальное разведение сыворотки, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии комплемента. В качестве рабочей дозы берут гемолитическую сыворотку в тройном титре.

РСК Вассермана ставится для диагностики сифилиса с целью обнаружения противотрепанемных антител в сыворотке крови, а также для определения эффективности специфической терапии. Она основана на принципе реакции связывания комплемента Борде-Жангу. Существенным отличием реакции Вассермана является применение двух диагностикумов - перекрестнореагирующих антигенов № 1 и № 2:

- диагностикум № 1 – специфический, трепонемный (взвесь убитых Tr. рallidum);

- диагностикум №2 – неспецифический, кардиолипиновый антиген (собой высокоочищенный экстракт бычьего сердца).

Одновременно с основным опытом ставят 2 контроля: с заведомо отрицательной и заведомо положительной сыворотками.

Первый период сифилиса является серонегативным и характеризуется отрицательной реакцией Вассермана. У 50% больных реакция становится положительной не ранее чем через 2-3 недели после появления твердого шанкра. Во втором и третьем периодах сифилиса частота положительных реакций достигает 75-90%. После проведенного курса лечения реакция Вассермана становится отрицательной.

Реакция может быть ложноположительной при ряде заболеваний и состояний: беременность, онкопроцессы, туберкулез, после приема жирной пищи и алкоголя и др.

Для диагностики поздних и латентных форм сифилиса можно ставить реакцию Вассермана, используя спинномозговую жидкость с теми же антигенами, что и в реакции с сывороткой больного.

РИБТ – реакции иммобилизации бледной трепонемы применяется для серологичекой диагностики сифилиса, то есть определения противотрепанемных антител в сыворотке кров. РИБТ позволяет дифференцировать биологически ложноположительные результаты реакции Вассермана и осадочных реакций от истинных, что делает ее незаменимой при распознавании скрытого сифилиса, диагноз которого может быть поставлен часто лишь на основании серологических исследований.

Ингредиенты:

· испытуемая сыворотка с противотрепанемными антителами (иммобилизины);

· антиген - взвесь бледных трепонем, полученный из яичка кролика зараженного сифилитическим орхитом;

· комплимент – сыворотка морских свинок в рабочей дозе;

В основе реакции лежит образование иммунного комплекса АГ-АТ-комплемент, что сопровождается активацией последнего и потерей подвижности T.рallidum. Учет реакции проводится микроскопированием препарата «раздавленной» капли.

 

Опсоно-фагоцитарная реакция

Применяется для определения опсонинов – антител, стимулирующих фагоцитарную активность лейкоцитов, т.е. серодиагностики инфекций, например, бруцеллёза.

Усиление фагоцитоза происходит за счёт присоединения опсонинов с активными центрами (Fав – фрагмент) к детерминантам бактерий, а затем с помощью Fc – фрагментов к Fc – рецепторам фагоцитов. В нормальной сыворотке содержится небольшое количество опсонинов, которые проявляют свое действие в присутствии комплемента. В иммунной сыворотке опсонинов больше и их активность в меньшей степени зависит от комплемента.

Компоненты	Опыт	Контроль
Исследуемая сыворотка Нормальная сыворотка Суточная микробная культура (напр., стафилококковая) Фагоциты – взвесь нейтрофилов	+ - + +	- + + +

Инкубация при 37°С в течение 30 минут. Из каждой пробирки готовят мазки, окрашивают по Романовскому – Гимзе и считают под микроскопом количество микробов в 100 и более нейтрофилах, т.е. определяют фагоцитарный показатель.

Фагоцитарный показатель – количество микробов, поглощенных одним нейтрофилом.

Опсонический индекс – фагоцитарный показатель иммунной (исследуемой) сыворотки / фагоцитарный показатель нормальной сыворотки.

Чем выше опсонический индекс (должен быть > 1), тем выше иммунитет.

Реакции непрямой иммунофлюоресценции (РИФ) (экспресс-диагностика и серологическая диагностика гриппа А)

В настоящее время широко применяются серологические реакции (СР), в которых участвуют меченые АГ или АТ. К ним относятся реакция иммунофлюоресценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы, реакция иммуноблотинга, проточная цитометрия и электронная микроскопия.

Они применяются:

1) для серодиагностики инфекционных заболеваний, т. е. для выявления АТ с помощью набора известных конъюгированных (химически соединённых) с различными метками (ферментами, флюорохромными красителями), антигенов;

2) для определения микроорганизма или его серовара с помощью стандартных меченных диагностических антител (экспресс-диагностика).

Готовят диагностические сыворотки иммунизацией животных соответствующим АГ, затем выделяют иммуноглобулины и конъюгируют их со светящимися красителями (флюорохромами), ферментами, радиоизотопами.

Диагностических моноклональных антител получают с помощью гибридных клеток, образованных путем слияния иммунного В-лимфоцита с миеломной клеткой. Гибридомы способны быстро размножаться in vitro в культуре клеток и продуцировать при этом иммуноглобулин, характерный для взятого В-лимфоцита.

Меченые СР по специфичности не уступают другим СР, а по своей чувствительности они превосходят все СР.