Принципы фиксации и визуализации биологических микроструктур. Фиксаторы и красители.

Принципы фиксации и визуализации биологических микроструктур. Фиксаторы и красители.

Взятие и фиксация материала

1. Из соответствующего органа вырезают небольшие кусочки (0,5 x 1 x 1 см) и погружают их в фиксатор (формалин, метанол и т.д.) - обычно на 24 ч.

2. Фиксация производится для предупреждения процессов аутолиза (самопереваривания) тканей.

Это достигается путём денатурации (коагуляции) белков.3. После фиксации образцы промывают проточной водой в течение нескольких часов.. Затем образцы уплотняют - чтобы в последующем их можно было резать на микротоме.

Часто в качестве уплотнителя используют парафин или целлоидин.

2. Предварительно образцы обезвоживают (иначе гидрофобный уплотнитель не сможет проникнуть в ткань). а) Для этого их “проводят” по батарее спиртов - 70 %, 80 %, 96 %, 100 % этанол - по 24 часа в каждом спирте. б) Т.к. парафин не растворим и в этаноле, образцы выдерживают потом в смеси этанол-ксилол и в чистом ксилоле. 3. Заливка: помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин

на 1-2 ч при 52-56 о С.

Дают парафину, остывая, затвердеть;

вырезают из него блок с заключённым образцом и

закрепляют на деревянном кубике. 1. Перед окрашиванием образцы освобождают от парафина, проводя по батарее растворителей:

ксилол, спирт 100 %, 96 %, 80 %, 70 %, 60 %, вода (по 2-5 мин)

(Этот ряд кончается водой в том случае, если затем используется водорастворимый краситель.)

2. Для окрашивания предметные стёкла со срезами

помещают на короткое время в раствор красителя, промывают водой, обрабатывают раствором другого красителя (если таковой используется тоже) и вновь промывают водой.

3.Препарат опять обезвоживают (проводя по батарее спиртов с возрастающей концентрацией), а затем просветляют (в карбол-ксилоле и ксилоле) - для удаления лишней краски. 4. Наконец, на препарат наносят каплю канадского бальзама (в случае среза) или
кедрового масла (на мазки крови) и накрывают покровным стеклом.

Общая хар-ка кл-ки. Химич-й состав и св-ва биомембран

Клетка — структурно-функц-ая элементарная единица строения и жизнед-ти всех организмов (кроме вирусов и вироидов).Обладает собственным обменом веществ, способна к самостоятельному существованию, самовоспроизведению (животные, растения и грибы). Функции кл-ки: 1.синтез пищеварительных ферментов или гомонов; 2.поглащение и переваривание микробов и других инородных тел; 3.осуществление и перенос О₂. Клетка состоит из 3 основных частей: 1.плазматич-я мембрана; 2.цитоплазма (содержатся рибосомы, митохондрии, ЭПС, комплекс Гольджи, лизосомы, плазмолеммы); 3.ядро (содержатся хромосомы). Цитоскелет клетки: актиновые нити, микротрубочки, промежуточные филоменты – волокна, способные поддерживать форму клетки и участвующие в двигательной функции клетки.

Наиб-е важными мембранами в животных клетках явл. плазматическая мембрана, внутренняя и внешняя ядерные мембраны, мембраны эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи, внутр-е и внеш-е митохондриальные мембраны. Пероксисомы и лизосомы, различные везикулы также отделены от цитоплазмы мембранами. Кл-ки растений сод-т дополнительно мембраны хлоропластов, лейкопластов и вакуолей.

Биомембраны состоят из липидов, белков и углеводов. Соотношение этих компонентов варьирует от одной мембраны к другой. Глав-ми компонентами обычно явл. белки, составл-е около половины от массы мембраны. Углеводы найдены только во внешнем слое; они составляют всего неск. % от массы мембраны. Напротив, для внутренней мембраны митохондрий характерны: низкое содержание липидов и высокий уровень белков.

Хемоосмотическая теория П. Митчела

Хемиосм. теория — учение о механизме преобразов-я энергии в биологических мембранах. Разработана П. Митчелом в 1961-1966 гг. Согласно этой теории, трансмемб­ранные потенциалы ионов могут служить источником энергии для синтеза АТФ, транспорта вещ-в и др. энергозависимых про­цессов в клетке. В частности, АТФ синтезируется за счет кинети­ческой энергии протона, проходящего через АТФ-синтетазу (спе­цифический тоннельный белок, пронизывающий мембрану).

РНК большой субъединицы

Высокомолекулярная РНК, составляющая структурную основу большой субъединицы рибосомы, обозначается как 23S рРНК (у бактерий) или 23S-подобная рРНК (в других случаях). Бактериальная 23S рРНК, также как и 16S рРНК, представляет собой одну ковалентно непрерывную полирибонуклеотидную цепь. В то же время 23S-подобная рРНК цитоплазматических рибосом эукариот состоит из двух прочно ассоциированных полирибонуклеотидных цепей — 28S и 5,8S рРНК (5,8S рРНК является структурным эквивалентом 5′-концевого ~160-нуклеотидного сегмента 23S рРНК, который оказался «отщеплён» в виде ковалентно обособленного фрагмента). 23S-подобная рРНК рибосом пластидов растений также состоит из двух прочно ассоциированных полирибонуклеотидных цепей и содержит 4,5S рРНК — структурный эквивалент 3′-концевого сегмента 23S рРНК. Известны случаи и ещё более глубоко зашедшей фрагментированности РНК, примером чего может служить 23S-подобная рРНК цитоплазматических рибосом некоторых протистов. Например, у Euglena gracilis — из 14.

Кроме вышеуказанной 23S(-подобной) рРНК, большая субъединица обычно содержит также относительно низкомолекулярную РНК — так называемую 5S рРНК. В отличие от вышеупомянутых 5,8S и 4,5S рРНК, 5S рРНК менее прочно ассоциирована с 23S(-подобной) рРНК входит в состав большой субъединицы цитоплазматических рибосом всех прокариот и эукариот, но, по-видимому, не является непременной составляющей любой функциональной рибосомы, так как 5S рРНК отсутствуют в митохондриальных рибосомах млекопитающихю Число нуклеотидных звеньев варьируется от 2900 до 5000. Большие субъединицы митохондриальных рибосом млекопитающих содержат относительно короткие 23S-подобные рРНК — всего 1560—1590 нуклеотидных остатков. Молекула 5,8S рРНК комплекса 28S•5,8S рРНК, характерного для цитоплазматических эукариотических рибосом, имеет длину около 160 нуклеотидных остатков. Длина 5S рРНК довольно консервативна и составляет 115—125 нуклеотидных остатков.

34. Ламины - это фибриллярные белки, обеспечивающие структурную функцию и регуляцию транскрипции в ядре клеток. Ламины взаимодействуют с мембранными белками, чтобы образовать ядерную ламину на внутренней стороне ядерной оболочки. Они задействованы в образовании оболочки ядра в ходе митоза, а также в позиционировании ядерных пор.

Поровые комплексы и их функции: В некоторых местах внутренняя и внешняя мембраны ядерной оболочки сливаются и образуют ядерные поры, через которые происходит материальный обмен между ядром и цитоплазмой. Ядерные поры занимают 3-35% поверхности ядерной оболочки. Они более многочисленны в ядрах интенсивно функционирующих клеток и отсутствуют в ядрах спермиев. Количество их зависит от интенсивности деления: чем клетка малдше, тем пор больше. Пора не является дыркой в ядре, а имеет сложную структуру: содержит 2 параллельных кольца (по одному с каждой поверхности кариолеммы), которые образованы 8 белковыми гранулами. От этих гранул к центру сходятся фибриллы, формирующие перегородку (диафрагму), в середине которой лежит центральная гранула. Совокупность структур, связанных с ядерной порой, называется комплексом ядерной поры. Это восьмиугольный цилиндр, состоящий из белков. Белки поровых комплексов структурно связаны с белками ядерной ламины, которая участвует в их организации. Он образует водный канал, по которому по градиенту концентрации свободно диффундируют молекулы воды, растворенные в ней газы и низкомолекулярные вещества, ионы. В результате содержимое ядра отличается от содержимого цитоплазмы по составу высокомолекулярных органических веществ, а по составу низкомолекулярных не отличается. Транспорт макромолекул происходит активно. На внутренней и наружной мембранах комплекса имеются рецепторы, обеспечивающие избирательный транспорт из ядра РНК, субъединиц рибосом (слишком велики для свободного прохождения пор – их транспорт, вероятно, сопровождается изменением конформации порового комплекса), а в ядро избирательно транспортируются синтезированные белки-гистоны и белки ламин, ферменты. Также комплекс ядерной поры обеспечивает регуляцию транспорта веществ между цитоплазмой и ядром.

35. Ахроматиновое веретено деления - структура, возникающая из микротрубочек в профазе митоза ипредставляющая собой систему тонких нитей, идущих от полюсов клетки к ее центру. В анафазе митоза А. веретено делениярастаскивает однохроматидные хромосомы к разным полюсам клетки.
Реснички и жгутики - Это специальные органеллы движения, встречающиеся в некоторых клетках различных организмов. В световом микроскопе эти структуры выглядят как тонкие выросты клетки. В основании ресничек (cilium) и жгутика flagellum) в цитоплазме видны хорошо красящиеся мелкие гранулы — базальные тельца (corpusculum basale). Длина ресничек 5—10 мкм, а длина жгутиков может достигать 150 мкм

Основной белок ресничек — тубулин — не способен к сокращению, укорочению. Вероятным кандидатом на роль сократимого белка считается белок «ручек» — динеин, так как он обладает АТФ-азной активностью. В последние годы для объяснения способа движения ресничек и жгутиков используется гипотеза «скользящих нитей». Известно, что сокращение мышечных волокон происходит за счет встречного скольжения фибрилл двух мышечных белков: миозина и актина; при этом также не происходит собственно укорачивания или сокращения отдельных мышечных белковых фибрилл. Предполагается, что незначительные смещения дублетов микротрубочек друг относительно друга могут вызвать изгиб всей реснички, а если такое локальное смещение будет происходить вдоль жгутика, то может возникнуть волнообразное его движение.

 

Мейоз. Типы мейоза.

Организмы, которые размножаются половым путем, образуют половые клетки, или гаметы. С помощью мейоза образуются и созревают половые клетки (сперматозоиды и яйцеклетки). С диплоидных клеток образуются гаплоидные.

 

В каждом разделе мейоза различают профазу, метафазу, анафазу и телофазу. Фазы первого раздела обозначают римской цифрой I (профаза I, метафаза I и т.д.), а фазы второго раздела цифрой II (профаза II, метафаза II и др.).

Профаза I. В отличие от митоза, где каждая отдельная хромосома ведет себя независимо от других и не влияет на их поведение, в профазе I мейоза гомологичные хромосомы объединяются, формируя парные образования. Это длительная и сложная фаза, она характеризуется определенными последовательными стадиями в зависимости от состояния хромосом.

Лептонема, или стадия длинных тонких слабоспирализированных нитей. Появляются заметные тонкие нити.

Зигонема, или стадия соединенных нитей. Гомологичные (одинаковые по строению) хромосомы сближаются, попарно образуя биваленты. Число их вдвое меньше, чем исходное количество хромосом. Взаимное притяжение хромосом получило название конъюгации. Конъюгация происходит очень точно, соединяются концы хромосом или по всей длине хромосом. Причем сближаются каждый хромомер и каждый участок одной гомологической нити с соответствующим хромомером и участком другой гомологичной нити.

Пахинема, или стадия толстых нитей. Процесс объединения гомологичных хромосом полностью завершается. Они должны быть настолько сближены, что их легко принять за одну..

Диплонема, или стадия двойных нитей. Хромосомы, которые были объединены в биваленты, начинают постепенно отталкиваться друг от друга, оставаясь соединенными между собой в отдельных участках (хиазмы). Каждая хромосома состоит из двух хроматид, а каждый бивалент образует тетраду. Переплетенная друг вокруг друга хромосома (биваленты) постепенно раскручиваются и уменьшается число хиазм.

Диакинез - заключительная стадия профазы I. В диакинезе биваленты резко укороченные, утолщенные дочерние хроматиды каждой хромосомы малозаметны. Хиазмы постепенно смещаются на конце хромосом. Завершается профаза I разрушением ядерной оболочки, формированием ахроматинового веретена.

Метафаза I. Число бивалентов вдвое меньше диплоидного набора хромосом. Они (биваленты) значительно короче хромосом в метафазе соматического митоза и размещаются в экваториальной плоскости.

Анафаза I. К противоположным полюсам веретена расходятся гомологичные хромосомы. Каждая из них состоит из двух дочерних хроматид, соединенных своими центромерами. В этом заключается существенное отличие от анафазы митоза. Происходит редукция центромер.

Телофаза I. Начинается, когда анафазные хромосомы достигли полюсов клетки, на каждом полюсе находится гаплоидных число хромосом. Характеризуется образованием ядерной мембраны и восстановлением структур ядра. Образуются две дочерние клетки.

Интерфаза между I и II делением мейоза бывает очень короткой. В отличие от обычной интерфазы здесь отсутствует репродукция хромосом. Мейоз II происходит по типу обычного митоза.

Профаза II. Кратковременная, хромосомы хорошо заметны.

Метафаза II. Хорошо заметна двойная структура хромосом и значительную степень их спирализация.

В анафазе II происходит различие удвоенных центромер, вследствие чего дочерние хроматиды движутся к разным полюсам.

В телофазе II образуются четыре клетки с гаплоидным набором хромосом.

 

46. Конъюгация гомологичных хромосом. Синаптонемальный комплекс, бивалент.

КОНЪЮГАЦИЯ ХРОМОСОМ- тесное соединение хромосом друг с другом у всех организмов, включая человека, обладающих сформированным клеточным ядром.Различают конъюгацию гомологичных и негомологичных хромосом. Конъюгация гомологичных хромосом является обязательным этапом мейоза,а также происходит в некоторых соматических клетках, напр, при формировании политенных (гигантских) хромосом. гомологичные хромосомы остаются соединенными до конца существования слюнных желез. онъюгация гомологичных хромосом в мейозе носит обратимый характер и лежит в основе точного разделения диплоидного набора хромосом на два гаплоидных набора, которые расходятся в разные клетки (редукция числа хромосом). Это явление создает условия для полового процесса и генетической рекомбинации у диплоидных организмов. Процесс конъюгации гомологичных хромосом происходит В профазе I мейотического деления и начинается на стадии зиготены.

Бивалент-пара гомологичных хромосом, связывающихся друг с другом во время мейоза посредством специального комплекса после удвоения хромосом. Биваленты образуются в тот момент, когда две гомологичные хромосомы подвергаются рекомбинации. Хромосомы движутся так, чтобы достаточно сблизить и скрепить соответствующие участки, подвергающиеся рекомбинации. Это скрепление обеспечивается белковым комплексом (синаптонемный комплекс),

 

Структурная классификация.

Безаксонные нейроны — небольшие клетки, сгруппированы вблизи спинного мозга в межпозвоночных ганглиях, не имеющие анатомических признаков разделения отростков на дендриты и аксоны.

Униполярные нейроны — нейроны с одним отростком, присутствуют, например в сенсорном ядре тройничного нерва в среднем мозге

Биполярные нейроны — нейроны, имеющие один аксон и один дендрит, расположенные в специализированных сенсорных органах — сетчатке глаза, обонятельном эпителии и луковице, слуховом и вестибулярном ганглиях.

Мультиполярные нейроны — нейроны с одним аксоном и несколькими дендритами. Данный вид нервных клеток преобладает в центральной нервной системе.

Псевдоуниполярные нейроны — От тела отходит один отросток, который сразу же Т-образно делится. Весь этот единый тракт покрыт миелиновой оболочкой и структурно представляет собой аксон.Структурно дендритами являются разветвления на конце этого (периферического) отростка. Триггерной зоной является начало этого разветвления (то есть находится вне тела клетки). Такие нейроны встречаются в спинальных ганглиях.

Принципы фиксации и визуализации биологических микроструктур. Фиксаторы и красители.

Взятие и фиксация материала

1. Из соответствующего органа вырезают небольшие кусочки (0,5 x 1 x 1 см) и погружают их в фиксатор (формалин, метанол и т.д.) - обычно на 24 ч.

2. Фиксация производится для предупреждения процессов аутолиза (самопереваривания) тканей.

Это достигается путём денатурации (коагуляции) белков.3. После фиксации образцы промывают проточной водой в течение нескольких часов.. Затем образцы уплотняют - чтобы в последующем их можно было резать на микротоме.

Часто в качестве уплотнителя используют парафин или целлоидин.

2. Предварительно образцы обезвоживают (иначе гидрофобный уплотнитель не сможет проникнуть в ткань). а) Для этого их “проводят” по батарее спиртов - 70 %, 80 %, 96 %, 100 % этанол - по 24 часа в каждом спирте. б) Т.к. парафин не растворим и в этаноле, образцы выдерживают потом в смеси этанол-ксилол и в чистом ксилоле. 3. Заливка: помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин

на 1-2 ч при 52-56 о С.

Дают парафину, остывая, затвердеть;

вырезают из него блок с заключённым образцом и

закрепляют на деревянном кубике. 1. Перед окрашиванием образцы освобождают от парафина, проводя по батарее растворителей:

ксилол, спирт 100 %, 96 %, 80 %, 70 %, 60 %, вода (по 2-5 мин)

(Этот ряд кончается водой в том случае, если затем используется водорастворимый краситель.)

2. Для окрашивания предметные стёкла со срезами

помещают на короткое время в раствор красителя, промывают водой, обрабатывают раствором другого красителя (если таковой используется тоже) и вновь промывают водой.

3.Препарат опять обезвоживают (проводя по батарее спиртов с возрастающей концентрацией), а затем просветляют (в карбол-ксилоле и ксилоле) - для удаления лишней краски. 4. Наконец, на препарат наносят каплю канадского бальзама (в случае среза) или
кедрового масла (на мазки крови) и накрывают покровным стеклом.